El gran avance que ha experimentado la biología molecular ha conducido al conocimiento preciso de la estructura y función de un gran número de genes, así como a la posibilidad de análisis y diagnóstico de diversas enfermedades hereditarias sobre la base de la caracterización del defecto génico responsable.
El DNA del genoma humano, al igual que el de otros genomas, no es una entidad estática, sino que está sujeto a una variedad de cambios o mutaciones. Si se dejan de lado los cambios que se refieren a la pérdida o ganancia de cromosomas, así como las roturas y los reagrupamientos responsables de translocaciones cromosómicas groseras, el estudio de las mutaciones que se producen a nivel molecular, en cuanto a la naturaleza, la frecuencia, los mecanismos de producción y la repercusión de éstas, es fundamental para el conocimiento de la fisiopatología de una enfermedad hereditaria monogénica, lo cual, entre otras cosas, permitirá conocer el efecto fenotípico de una determinada mutación, así como establecer medidas terapéuticas racionales.
Las mutaciones se producen como consecuencia de errores en los procesos endógenos, como la replicación y la reparación del DNA, o bien pueden ser inducidas por factores exógenos, como radiaciones ionizantes y mutágenos químicos. Las mutaciones inducidas son mucho más frecuentes que las espontáneas, y probablemente los mecanismos que las producen sean distintos.
Una mutación puede surgir en las células somáticas o en las células germinales. En este último caso, si la mutación germinal no afecta la esperanza de vida del individuo ni a su capacidad reproductora, esta mutación puede ser transmitida hereditariamente.
No todas las mutaciones que ocurren en el DNA tienen consecuencias patológicas; así, por ejemplo, existen variaciones alélicas de secuencia, denominadas polimorfismos de DNA, que se basan en mutaciones que no tienen repercusión fenotípica. Pero otros cambios mutacionales, como la mayoría de los que se producen en las secuencias génicas que codifican para las proteínas, alteran en mayor o menor grado la funcionalidad de la proteína en cuestión, lo cual se traduce clínicamente de forma característica para cada gen mutado. En la mayoría de las enfermedades hereditarias se han identificado diferentes tipos de mutaciones o cambios en el gen responsable; así, en la fibrosis quística, una de las enfermedades más heterogéneas desde el punto de vista molecular, se identificaron hasta el momento alrededor de 500 mutaciones distintas en el gen CFTR.
Existe una considerable variación en cuanto al número de mutaciones y proporciones relativas de los diferentes tipos en los distintos loci génicos que no puede atribuirse simplemente al azar. Algunas secuencias de DNA son más propensas a mutar que otras y lo hacen en una forma y frecuencia determinadas. Esto puede reflejar características génicas individuales tales como longitud, número de secuencias repetidas, frecuencia de dinucleótido CpG, y otras. También, y debido al hecho de que un gran número de mutaciones provienen de errores en la replicación o reparación del DNA, es lógico pensar que a mayor número de replicaciones o divisiones mayor será la probabilidad de mutar. Por eso el DNA mitocondrial tiene un índice mayor de mutaciones que el nuclear y se producen más mutaciones en la gametogénesis masculina que en la femenina.
En el genoma humano pueden surgir distintos tipos de mutaciones, y cada una puede producirse por varios mecanismos. Las más comunes son las sustituciones simples de una base seguidas por deleciones e inserciones. Posiblemente menos habituales, aunque se están detectando cada vez más casos a medida que se conocen los mecanismos de producción, son otros tipos de mutaciones entre las que destacan las expansiones de secuencias repetidas inestables, la conversión génica y la fusión génica. En este apartado se analizarán en forma detallada algunas de ellas, y más adelante se describirán las expansiones de secuencias repetidas inestables, ya que este tipo de mutación merece una mención especial porque está revolucionando el campo de las alteraciones moleculares.
SUSTITUCIÓN DE UNA BASE
Una base es reemplazada por otra, lo cual puede tener repercusiones biológicas si el cambio ocurre en secuencias de DNA importantes para la transcripción o para la correcta traducción del mRNA. El dinucleótido CpG representa un punto caliente (hotspot) para este tipo de mutaciones, debido a que la citosina se encuentra a menudo mediada, lo que facilita su deaminación, que la convertiría en timina.
Las mutaciones puntuales como las que ocurren en los dinucleótidos CpG y que suponen la sustitución de una pirimidina (C o T) por otra pirimidina, o el cambio de una purina (A o G) por otra purina, se conocen con el nombre de transiciones. Si se sustituye una pirimidina por una purina, o viceversa, el cambio se denomina transversión. En contra de lo que es previsible lógicamente en función del mayor número de combinaciones posibles, en el genoma de los mamíferos se observa un número mayor de transiciones que de transversiones.
Inicialmente se han descrito incidencias elevadas de mutaciones en secuencias CpG en el gen del factor VIII, causantes de hemofilia A, así como en el gen del factor IX, que conducen a la hemofilia B; en ambas se presentaron en el 35 % de los casos. Posteriormente se describieron sustituciones CG a TG o CA en una amplia variedad de genes como ADA, apo E y gen del factor von Willebrand, en los cuales este tipo de mutaciones se encuentran con frecuencias de hasta el 60 %. Hay que hacer constar que estos cambios son más comunes en células germinales masculinas a causa del diferente nivel de mediación del DNA en esas células con respecto a las femeninas.
Existen otros mecanismos de producción de mutaciones basadas en la sustitución de una base, como ocurre cuando se producen errores de complementación o incorporación de bases durante el proceso de replicación del DNA que, como se verá más adelante, es un mecanismo frecuente de cambios mutacionales en el que intervienen un número pequeño de bases. Se han observado mutaciones de este tipo en las regiones que flanquean a deleciones e inserciones, ya que las roturas y fusiones posteriores predisponen a ellas.
En cualquier caso, la sustitución de una base por otra puede ocurrir en secuencias de DNA codificante o no codificante; las primeras son las que pueden tener con mayor frecuencia consecuencias patológicas. De este modo, en lo que respecta a las sustituciones en el DNA codificante se debe hacer constar que la mutación en sí puede no alterar la composición de la cadena polipeptídica, y en ese caso se trata de una mutación silenciosa (la mayor parte de las sustituciones en bases que ocupan la tercera posición de los codones), o, lo que es más probable, provocar el cambio de la naturaleza del aminoácido codificado, y entonces se dice que es una mutación no silenciosa (sustituciones en bases situadas en la primera y segunda posiciones).
Las mutaciones no silenciosas pueden, a su vez, producir el cambio a un codón de parada, lo que se conoce como mutación sin sentido (nonsense), que provoca una interrupción brusca y prematura de la secuencia polipeptídica, o, simplemente, cambia el aminoácido que originalmente codificaba, en cuyo caso se la denomina mutación con pérdida de sentido (missense).
Las consecuencias fenotípicas del cambio de un aminoácido por otro se relacionan con la magnitud del aminoácido reemplazado en lo que respecta a su localization y diferencia química (composición, polaridad y volumen molecular). Hay aminoácidos que tienen interacciones críticas (puentes disulfuro, fuerzas hidrofóbicas, enlaces iónicos); por eso, cuando uno de ellos es sustituido por otro que no tenga la misma función, la estructura proteica se desestabiliza profundamente y la repercusión clínica será evidente.
No obstante, es interesante destacar que existe un proceso de selección natural, basado en estrategias diversas, que impide o al menos aminora en ocasiones las repercusiones fenotípicas de mutaciones que pueden tener graves efectos en la expresión génica. Por ejemplo, en el caso de mutaciones sin sentido que podrían abolir la función génica, algunas veces se produce, por ese proceso de selección natural, una eliminación del exón donde se encuentra la mutación durante el procesamiento del mRNA, porque se considera que ello puede repercutir menos intensamente en la función proteica. Éste es el caso de algunas variantes leves de la enfermedad de Menkes, como la denominada Ehlers-Danlos tipo IX o cutis laxa ligada al X; a pesar de que tiene una mutación de parada en medio del gen, una proporción de su mRNA carece del exón correspondiente, mientras que la mayoría de las señales prematuras de parada dan lugar al fenotipo Menkes clásico, más agresivo. Este mismo proceso de selección natural contribuye a que sean menos frecuentes las sustituciones en los genes que codifican proteínas cuyas secuencias están muy conservadas a lo largo de diferentes especies, como ocurre en las histonas H3 y H4 o calmodulina. También es responsable de que muchas mutaciones de novo no silenciosas en el DNA codificante reduzcan la eficacia de sus portadores.
Es posible que las mutaciones del tipo de sustitución de una base en secuencias del DNA no codificante no tengan repercusiones patológicas, como en el caso citado antes de polimorfismos de DNA (variaciones alélicas en la población que rara vez aparecen de novo), pero puede ser que se produzcan si ocurren en secuencias relevantes como: sitios de splicing o de procesamiento de intrones, en los que las mutaciones dan lugar a un mRNA total o parcialmente afuncional; mutaciones en la región promotora del gen (TATA box o CCAAT box) que afectan la transcripción, o mutaciones en el sitio de poliadenilación del mRNA, que pueden producir un efecto regulador negativo en la expresión génica.
Las mutaciones que afectan el procesamiento del mRNA suelen producirse en las secuencias de consenso en el extremo 5' o 3' de cada intrón, y a menudo provocan la eliminación del exón correspondiente o la aparición de sitios de splicing alternativos en la vecindad. Otras veces, sustituciones fuera de las secuencias de consenso activan sitios crípticos de procesamiento de intrones, es decir, que secuencias similares a las del consenso, que normalmente no llegan a ser reconocidas, se activan por un pequeño cambio que las hace más similares a las funcionales. Todo esto produce un mRNA aberrante, por pérdida parcial de secuencia codificante o, por el contrario, por adición de secuencias intrónicas que generalmente conllevan una señal de parada temprana, con lo cual la proteína estaría también incompleta.
Las mutaciones en secuencias reguladoras o de control, como las que ocurren lugar en la región promotora y las que afectan el lugar de poliadenilación, alteran el proceso normal de activación génica o de iniciación y terminación de la transcripción. Son, como las que afectan el procesamiento, más cuantitativas que cualitativas, ya que provocan un incremento o una disminución del mRNA.
Las mutaciones en el gen de la (3-globina, si son del tipo de las que producen cambios en la pauta de lectura, las mutaciones sin sentido y algunas de las que afectan el procesamiento del mRNA, suelen producir talasemia (3o, mientras que aquellas que surgen en la región promotora, de poliadenilación, y la mayoría de las que alteran el procesamiento provocan (3-talasemia positiva.
DELECION
La delecion es otro tipo de mutación que con frecuencia causa enfermedad hereditaria monogénica. La delecion puede suponer la pérdida de una o varias bases, detectable sólo a nivel molecular, o bien, que el tamaño del fragmento delecionado sea tan grande que se pueda evidenciar por métodos citogenéticos, como cuando la rotura cromosómica ha implicado la pérdida de parte de un cromosoma.
Dejando de lado las grandes deleciones citogenéticas, algunas de ellas incompatibles con la vida, y citando sólo algunos ejemplos típicos de microdeleciones tales como ciertos casos de retinoblastoma hereditario (delecion en la región ql4 del cromosoma 13) y síndrome de Di George (delecion en qll del cromosoma 22) se hará hincapié sobre todo en las deleciones a nivel molecular.
Éstas pueden abarcar fragmentos de DNA de varios cientos de pares de bases como las que se observan, por ejemplo, en aproximadamente el 70 % de los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y en el 84 % de los que padecen a-talasemias, déficit de adenosindesaminasa o hipercolesterolemia.
El mecanismo de producción de estas deleciones es, habitualmente, una recombinación homologa desigual durante la meiosis o, con menor frecuencia, en la mitosis. Un alto grado de homología entre secuencias no alélicas, situadas en cromátides no hermanas de un par de homólogos, o en cromátides hermanas, predispone a un intercambio desigual entre ellas, lo que puede tener como consecuencia una deleción en una de las cromátides, o una duplicación en la otra. Una recombinación desigual entre secuencias homologas orientadas en sentido inverso dentro de una misma cromátide también favorece la aparición de deleciones, así como de inversiones.
Existen secuencias repetitivas cortas (2 a 8 bases), que también contribuyen a generar deleciones cuando se encuentran dos copias próximas, aunque en este caso la deleción suele producirse por un apareamiento incorrecto durante la replicación (slipped mispairing); a esto parece contribuir la actividad reparadora de la DNA-polimerasa: la complementación anómala de una copia genera un bucle de cadena sencilla que se escindirá por mediación del sistema de reparación. Es habitual encontrar este tipo de secuencias cortas junto a los sitios de rotura en deleciones de pequeño tamaño que conllevan la pérdida de una de las dos copias.
La pérdida de material genético puede ser de un número pequeño de bases, e incluso de un solo nucleótido. Se ha descrito que las deleciones de un solo nucleótido suponen alrededor del 40 % de todas las deleciones menores de 21 pb, y en el 29 % de éstas las deleciones comprenden 2 o 3 nucleótidos.
Las deleciones en secuencias codificantes se denominan mutaciones frameshift si la deleción (esto también vale en el caso de inserción) produce deslizamiento de la pauta de lectura, lo cual resulta en una secuencia polipeptídica totalmente anómala a partir de ella. En otras ocasiones la deleción no cambia la pauta de lectura porque el número de bases delecionadas es múltiplo de tres, y sólo provoca la pérdida de uno o varios aminoácidos de la proteína, manteniéndose intactos los restantes. La alteración o no alteración de la pauta de lectura depende de las deleciones en el gen de la distrofina provoquen un fenotipo de distrofia muscular de Duchenne o la forma más leve de distrofia muscular de Becker, respectivamente. Las deleciones o inserciones producen muy a menudo el desplazamiento de la pauta de lectura, lo cual suele suponer la aparición de un codón de parada situado algunas bases más adelante y la interrupción brusca de la síntesis proteica.
DUPLICACIÓN, INVERSION, INSERCIÓN, FUSIÓN Y CONVERSIÓN GENICA
Como se ha señalado, las secuencias repetitivas de DNA provocan con frecuencia mutaciones patogénicas mediante diversos mecanismos. Así, una recombinación homologa desigual entre secuencias de este tipo, sobre todo las de moderado a gran tamaño, situadas en cromátides no hermanas, o un intercambio desigual entre dichas secuencias si se encuentran en cromátides hermanas, puede predisponer no sólo a deleciones grandes, sino también a duplicaciones u otro tipo de inserción, así como a inversiones si las secuencias están orientadas en sentido opuesto dentro de la misma cromátide. La función de un gen que se encuentra en la proximidad de las secuencias repetidas recombinantes puede resultar alterada por dichos sucesos; es lo que ocurre en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo IA, donde la duplicación de un segmento que incluye el gen PMP-22, secundaria a una recombinación homologa desigual, es la causa más frecuente de aparición de esta afección. Un ejemplo típico de inversión por recombinación homologa desigual dentro de la misma cromátide es el que ocurre en la hemofilia A, donde aproximadamente en el 50 % de pacientes con la forma grave de la enfermedad se detecta una inversión, producida por una recombinación desigual entre genes homólogos situados dentro y fuera del gen factor VIII, que se transcriben en sentido opuesto. La existencia de secuencias repetitivas cortas en el interior de un gen o cerca de él también predispone, por el mecanismo de slipped mispairing, a la aparición de estos sucesos mutacionales que, aunque de menor tamaño, pueden alterar asimismo la naturaleza de la proteína codificada. Existen otros mecanismos menos frecuentes de producción de mutaciones génicas; concretamente, se describieron inserciones de gran tamaño en diversos genes como, por ejemplo, en el gen factor VIII, en el gen NF1 de la neurofibromatosis tipo 1 y en el gen de la colinesterasa. En estos casos la inserción suele producirse por un mecanismo de retrotransposición y los elementos repetitivos insertados son del tipo LINE-1 (elementos largos repetitivos interpuestos) o Alu. Más aún, la presencia de genes próximos con un alto grado de homología entre sí, puede igualmente provocar deleción, duplicación, inserción, fusión o inversión génica por un mecanismo de recombinación homologa desigual entre ellos. En este sentido, es interesante hacer notar que de algunos genes existen dos copias, una de ellas funcional y la otra afuncional (seudogén), que presentan un alto grado de homología entre sí y están situadas, por lo general, muy próximas en el genoma. Un intercambio desigual entre ambas copias, con puntos de rotura y fusión intragénicos, es un mecanismo frecuente de mutación patogénica, fundamentalmente deleción, pero también se produce por este mecanismo la denominada fusión génica, con formación de un nuevo gen que contiene secuenicas de ambas copias. Cuando el intercambio de secuencias entre genes, alélicos o no alélicos, no es recíproco como en los casos anteriores, el resultado es una conversión génica, mediante la cual el seudogén, que por lo general contiene cierto grado de mutaciones, es copiado parcial o totalmente en el gen funcionante. El 25 % de las mutaciones patogénicas en el gen de la 21-hidroxilasa se deben a un intercambio o recombinación desigual entre el gen CYP21B y su copia afuncional CYP21A. En el 75 % de los casos el mecanismo implicado es el de conversión génica.
Como ejemplo de fusión génica, producida también por recombinación homologa desigual, con los puntos de rotura y fusión en dos genes distintos (lo que provoca un gen híbrido entre ambos) puede citarse el caso de la hemoglobina Lepore.
En la mayoría de las enfermedades hereditarias cuyo gen responsable ha sido identificado, se ha descrito un número variable de mutaciones distintas en cuanto a la naturaleza y la situación en el gen (lo que se conoce como heterogeneidad molecular o alélica), aunque es frecuente el hecho de que alguna o unas pocas se presenten con mayor frecuencia. Más aún, las mutaciones en genes ubicados en distintos loci pueden manifestarse clínicamente en forma similar (heterogeneidad genética). Por eso, hasta ahora, y con los conocimientos de que se dispone, en algunas enfermedades hereditarias es difícil predecir la repercusión fenotípica de una determinada mutación genética, debido a que los síntomas clínicos son, muchas veces, el resultado final de una larga cadena de sucesos que se producen como consecuencia de la alteración de complejas interacciones proteicas.
