La medicina actual no está todavía en condiciones de tratar la mayoría de las enfermedades desde el punto de vista etiológico. Esto se debe sobre todo a que en la actualidad se sabe muy poco acerca de la fisiopatología de las enfermedades. Los nuevos conocimientos moleculares sobre los procesos patológicos humanos y los avances tecnológicos en el campo de la biología celular y molecular sugieren que en el futuro será posible luchar contra las enfermedades de manera más eficaz. La tecnología del DNA ha realizado importantes aportes a la medicina durante los últimos 25 años, principalmente en lo que respecta al conocimiento sobre las bases moleculares de las enfermedades, al desarrollo del diagnóstico molecular y a la producción de fármacos mediante ingeniería genética. Uno de los capítulos de la medicina molecular se centra en el desarrollo y la aplicación de los genes como herramientas terapéuticas, es decir, en la utilización del material genético para corregir las alteraciones clínicas que existen en el estado patológico.
El concepto de terapia génica incluye varias formas de lucha contra la enfermedad mediante el empleo de genes, de ingeniería genética y de biología celular. De hecho, aun el término terapia génica puede no ser del todo correcto puesto que lleva implícito el concepto de curación, que en la mayoría de los casos no se produce. Así, el término transferencia génica puede ser más adecuado en el período de desarrollo actual de esta tecnología. La transferencia de genes tiene como objetivo corregir un defecto genético, bloquear una alteración molecular determinada o sus efectos, o facilitar otras estrategias terapéuticas. Existen dos grandes vías para realizar la transferencia de genes: a) obtener células del paciente, modificarlas ex vivo y reintroducirlas en el propio paciente, y introducir directamente el gen que se ha de transferir in vivo en las células del tejido que se desea modificar.
El primer ensayo clínico de terapia génica en seres humanos se realizó en 1990, con el propósito de corregir el déficit de adenosindesaminasa (ADA). En los últimos 5 años se ha producido una verdadera explosión en el campo de la transferencia génica, y cada vez aumenta más el número de investigadores que estudian distintos aspectos de esta disciplina; al mismo tiempo, se han diseñado y aprobado más de 200 protocolos clínicos. A pesar del enorme número de proyectos y protocolos de transferencia génica, no existe ninguna enfermedad en la cual esta tecnología haya sido lo bastante eficaz como para que puedan realizarse aplicaciones clínicas amplias a los pacientes. De este modo, la investigación actual se centra en el desarrollo de nuevos métodos para transferir los genes, evaluar los efectos nocivos de esta transferencia, dirigir y controlar la expresión de los genes transferidos y establecer los modelos clínicos para las aplicaciones amplias a los pacientes.
TRANSFERENCIA DE GENES
Desde el punto de vista específico de la transferencia génica con propósitos clínicos, pueden considerarse dos formas de introducir un gen en las células eucariotas: mediante virus (retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y virus herpes, principalmente) o empleando métodos químicos (sobre todo, liposomas o conjugados que ligan DNA). Los genes introducidos mediante retrovirus y virus adenoasociados se integran de manera estable en el genoma de la célula, con la posibilidad de una expresión permanente. Los retrovirus se emplean por lo general ex vivo, reintroduciendo en el organismo las células modificadas. La transferencia mediante otras vías suele producir una expresión transitoria del gen y se realiza casi siempre in vivo.
Vectores
Virus
Los virus tienen grandes ventajas como vectores para la transferencia de genes: a) infectan a casi todas las células; b) en condiciones adecuadas sólo una copia se integra en el genoma; c) la estructura del genoma vírico se conoce muy bien; d) la infección y la manipulación de las células por lo general no producen lesiones, y e) todas las etapas del proceso son controlables.
Se han señalado algunos problemas en el empleo de virus para la transferencia génica: a) el DNA del vector vírico podría insertarse en una región esencial del genoma, activando un oncogen; b) el vector vírico podría activar un virus lento, y c) el vector vírico podría transformarse en un virus patológico infeccioso al recombinar con secuencias de la célula huésped. Por eso, es preciso emplear virus que den lugar a la expresión estable y eficaz de los genes introducidos y que dirijan una integración que no lesione el genoma de las células huéspedes.
Los vectores retrovíricos infectan varios tipos de células, pero necesitan que éstas se dividan para que la forma de provirus (DNA) se integre en el genoma. Los retrovirus para la transferencia de genes derivan de modificaciones de retrovirus como el virus murino de Moloney (Mo-MLV). El vector conserva las secuencias LTR (long terminal repeat) para el control de la transcripción e integración en la célula huésped, la secuencia para la encapsulación y la secuencia PB para la replicación vírica. En el genoma de la célula huésped existen lugares de inserción preferenciales para los retrovirus. Los otros genes víricos se sustituyen por el gen que se desea transferir. Este gen se ha preparado en forma conveniente, mediante la introducción de secuencias promotoras del propio gen o de otro, que le confieren especificidad de tejido en su expresión. También puede introducirse un gen marcador que permitirá seleccionar las células que han integrado el gen transferido o seguir la expresión de éste. Para obtener copias suficientes del virus defectuoso es necesaria su multiplicación in vitro en células que contengan un virus colaborador (helper); éste tiene los genes retrovíricos necesarios para la multiplicación del virus, que se complementan con los del retrovirus modificado con la secuencia que se va a transferir. En las células diana estos virus no podrán multiplicarse porque no poseen el virus helper, y se limitan a la integración en el genoma. Los retrovirus son ideales para las aplicaciones ex vivo y permiten la transferencia génica prácticamente a todas las células diana.
Una de las limitaciones de los retrovirus (aunque también constituye una ventaja) es la necesidad de integrarse en el genoma de la célula diana, para lo cual precisan células en división; los adenovirus, en cambio, pueden infectar eficazmente células que no están en fase de división. Tienen aplicaciones para la terapia génica in vivo. La eliminación de varios de los genes de adenovirus (E1A-E1B y E3) permite insertar fragmentos de DNA de hasta 7 kb. Los principales problemas de los adenovirus son la capacidad para replicar in vivo (que depende del tipo de la célula diana), la toxicidad de algunos de sus productos proteicos, la respuesta inmunitaria contra las células diana y la transitoriedad de la expresión de los genes transferidos.
Existen otros vectores víricos que se están estudiando para la terapia génica: virus adenoasociados, virus del grupo herpes y virus RNA. Los virus adenoasociados son muy estables y producen integración en el cromosoma 19 humano. Los virus del grupo herpes podrían tener importantes aplicaciones para los procesos patológicos del SNC. Otros vectores, como los virus de la poliomelitis y los virus RNA, se están investigando con el propósito de aplicarlos a la transferencia de genes con finalidades clínicas.
Métodos no víricos
Los complejos entre el DNA de los plásmidos y los ligandos polipeptídicos pueden ser reconocidos por receptores de la superficie celular y provocar la endocitosis mediada por estos receptores. Estos complejos plásmido-liposoma constituyen una interesante alternativa a los sistemas víricos de transferencia de genes.
Los liposomas son lípidos catiónicos sintéticos a los cuales se les puede unir un plásmido que contiene el gen que se desea transferir, junto con las secuencias necesarias para su expresión correcta. El material genético que se introduce en la célula deberá llegar al núcleo de ésta para iniciar los distintos pasos de transcripción y posterior traducción proteica. Los liposomas tienen, en comparación con los vectores víricos, una enorme ventaja para la transferencia de genes. En primer lugar, no existe limitación con respecto al tamaño del material genético que se puede introducir. Segundo, como no se trata de secuencias víricas, el material genético que se introduce no puede replicarse o recombinar para dar lugar a un virus con capacidad infectiva. Por último, no se produce respuesta inflamatoria o inmunológica ante los liposomas. A pesar de las ventajas de estos vectores, hace falta una gran cantidad de plásmidos para que la transferencia génica sea eficaz y la expresión de los genes introducidos mediante liposomas es casi siempre muy transitoria. Los liposomas se han empleado en experiencias de transferencia génica in vivo en pacientes con fibrosis quística pero su eficacia ha sido muy limitada. Existen otros métodos para transferir genes, entre ellos la electroporación y la microinyección. A pesar de que la microinyección ha tenido resultados muy positivos en la obtención de animales transgénicos, es de difícil aplicación con finalidades terapéuticas.
ENSAYOS CLÍNICOS DE TERAPIA GÉNICA
Es muy probable que la transferencia génica ejerza un gran impacto sobre el tratamiento de enfermedades para las cuales no se dispone en la actualidad de una terapéutica adecuada. Tanto las enfermedades hereditarias como el cáncer y el SIDA podrán tratarse de manera eficaz en las próximas décadas mediante terapia génica. Existen más de 200 protocolos clínicos experimentales de terapia génica desarrollados en distintos países. A pesar de que algunas experiencias clínicas de terapia génica han sido decepcionantes, se espera que el número de protocolos clínicos con resultados positivos aumente en forma espectacular en los próximos años.
Enfermedades hereditarias
La experiencia inicial y más extensa de terapia génica para enfermedades hereditarias se ha centrado en la inmu-nodeficiencia combinada grave o déficit de ADA. La primera experiencia de terapia génica en esta afección se realizó en 1990 y consistió en obtener linfocitos del propio paciente, estimular la división de las células T, incubarlas con un retrovirus con el gen ADA normal y un gen de resistencia a la neomicina (neo), para después reintroducirlas en el paciente. Las células T periféricas se corrigieron mediante tratamientos de mantenimiento cada 6 meses. Sin embargo, este tratamiento no tiene resultados permanentes; es necesario realizar terapia génica no sólo sobre las células T maduras sino sobre las células progenituras (población de precursores hematológicos CD34+). Estas experiencias mostraron una respuesta satisfactoria, con aumento de los niveles de células T y de ADA. Sin embargo, debido a que estos pacientes continuaron el tratamiento enzimático con ADA, es difícil evaluar la contribución real de la transferencia génica.
Las células hepáticas han sido modificadas genéticamente con el propósito de tratar varios trastornos de origen genético. Las propias células del paciente se tratan ex vivo mediante un retrovirus portador del gen determinado y después se las reintroduce en el paciente por vía esplénica o portal, lo que permite reimplantar las células modificadas en el hígado. A pesar de que la implantación de las células modificadas genéticamente se ha evaluado sólo en un 10 %, la expresión de los genes transferidos se mantiene incluso durante años. Se han realizado varias experiencias de terapia génica para el déficit del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL-R), que interviene en la hipercolesterolemia familiar. El tratamiento de las células hepáticas del paciente con retrovirus portadores del gen normal y su reintroducción permite implantarlas en el hígado, con una producción de LDL-R suficiente como para normalizar los niveles de colesterol y LDL. Sin embargo, también en estos casos los pacientes han recibido otros tratamientos, por lo cual es difícil evaluar la contribución del gen transferido a su evolución clínica.
Se piensa que el hígado puede servir como vehículo para el tratamiento de un considerable número de enfermedades metabólicas, como el déficit de arantitripsina, de fenilalanina-hidroxilasa y otras. En este sentido, se están realizando varios experimentos que emplean como vectores retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados o complejos plásmido-liposomas. Sin embargo, la terapia génica que utiliza células hepáticas requiere una parte quirúrgica especializada, cuya realización en un gran número de pacientes plantea ciertas dificultades.
En las enfermedades respiratorias la terapia génica se ha centrado en la introducción del gen normal in vivo. Entre los vectores empleados se encuentran los adenovirus y los complejos plásmido-liposomas, pero también se estudiaron recientemente los virus adenoasociados. La fibrosis quística y el déficit de arantitripsina son las dos enfermedades hereditarias sobre las que se están realizando experiencias clínicas en la actualidad. Éstas no han sido muy satisfactorias y han mostrado las principales dificultades de los tratamientos in vivo. En el caso del gen de la fibrosis quística (CFTR), tanto los adenovirus como los liposomas lograron corregir en forma transitoria el defecto genético. Si bien se obtuvieron transferencias génicas eficaces, la expresión del gen sólo se mantiene pocas semanas, y es más duradera con los adenovirus que con los complejos plásmido-liposoma. Por otra parte, los adenovirus provocaron problemas inflamatorios e inmunológicos, lo cual tuvo como consecuencia la interrupción de gran parte de los ensayos clínicos de terapia génica de estas enfermedades con este tipo de vectores, en las condiciones actuales.
Los fibroblastos, los miocitos y los queratinocitos son poblaciones celulares susceptibles de recibir los genes que se encuentran alterados en un número considerable de enfermedades hereditarias, entre las que destacan varios trastornos de la coagulación, como la hemofilia A o B, las distrofias musculares hereditarias y diversas enfermedades metabólicas.
El descubrimiento de genes que afectan el SNC y el sistema neuromuscular, como los de la corea de Huntington, la ataxia dominante tipo 1, la neurofibromatosis tipos 1 y 2, la distrofia miotónica, la distrofia muscular de Duchenne, la atrofia muscular espinal, el retraso mental ligado al síndrome del cromosoma X frágil, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica y otras ha hecho posible la investigación sobre terapia génica para estos procesos.
Enfermedades neoplásicas
Uno de los campos en los cuales se ha desarrollado especialmente la terapia génica es el de las enfermedades neoplásicas. Gran parte de la experiencia actual en terapia génica del cáncer se centra en la modificación genética de los linfocitos específicos de los tumores y de las células tumorales para que depositen en el tumor citocinas y otros productos con actividad antitumoral.
Células tumorales modificadas
En la actualidad se producen vacunas celulares autólogas para el tratamiento y prevención del cáncer; el procedimiento consiste en la resección quirúrgica de células tumorales del paciente, su crecimiento en cultivo y la inserción in vitro de genes inmunostimulantes. Estas células se reintroducen en el paciente para provocar una respuesta inmunitaria sistémica que destruya el tumor y vacune al paciente para impedir posibles recaídas. La alteración de las células tumorales con genes que codifican para interleucinas (IL-1(3, IL-2, IL-4 e IL-6) factor de necrosis tumoral alfa, factor estimulante de colonias granulocíticas-monocíticas o IFN-7 produce la destrucción de las células tumorales in vivo.
Existen varios protocolos clínicos para la terapia génica del melanoma, el cáncer de colon, el carcinoma de células renales, el neuroblastoma, el cáncer de mama o el cáncer de pulmón de células pequeñas, en los cuales se infectan in vitro las células tumorales con retrovirus que contienen los genes IL-2, TNF-a o GM-CSF para reinyectarlas posteriormente a los pacientes. La modificación de fibroblastos del propio paciente y su reinyección, junto con células tumorales irradiadas, constituye otra técnica similar.
Linfocitos T modificados genéticamente
Varios protocolos de terapia génica se basan en la capacidad de los linfocitos T para proporcionar citocinas directamente en el tumor. Con esto se pretende mejorar su actividad antitumoral y evitar los efectos colaterales de su administración sistémica. Existen protocolos para el empleo de linfocitos T infiltrantes de tumores con TNF modificado para el tratamiento del melanoma maligno.
Inserción de un gen suicida
La terapia génica mediante genes que activan un profármaco no tóxico hacia un agente muy tóxico también está en desarrollo. El gen timidincinasa del virus del herpes simple confiere sensibilidad al fármaco antiherpes ganciclovir, mediante la fosforilación de GCV a la forma monofosfato. La fosforilación a la forma trifosfato GCV-TP por parte de las cinasas celulares inhibe la DNA-polimerasa y causa la muerte celular. Este efecto no se circunscribe a las células que tienen el gen modificado, sino que sucede en células adyacentes, en las que el GCV-TP se ha difundido.
Otras aproximaciones a la transferencia génica en las enfermedades neoplásicas
El gen MDR-1 confiere protección a las células contra los efectos tóxicos de varios agentes quimioterapéuticos. La modificación de las células hemopoyéticas ex vivo con el gen MDR-1 y su posterior reintroducción en el individuo confiere a estas células un efecto protector frente a los agentes quimioterapéuticos y permite emplearlos en dosis más elevadas que las habituales.
La respuesta inmunitaria ante el tumor aumenta cuando las células tumorales expresan antígenos en la superficie celular. Es posible modificar las células tumorales mediante la inyección, en el tumor, de liposomas que contengan el gen que codifica para HLA-B7, un antígeno que se expresa en forma transitoria en la superficie celular e induce la reacción inmunitaria contra esas células. Este tipo de estrategia también puede realizarse empleando genes para (32-microglobulina. Las experiencias clínicas en este tipo de tratamiento se han desarrollado en casos de melanoma maligno y cáncer de colon.
En algunos tumores cerebrales se ha realizado la transferencia de genes in vivo mediante vectores retrovíricos. En estos tumores se han implantado fibroblastos que producen vectores retrovíricos que contienen el gen HSVtk. En el tratamiento del cáncer de pulmón existe un protocolo en el que se inyectan directamente retrovirus con copias de genes involucrados en la transformación maligna, como el gen supresor p53, o el oncogén K-ras, según la ausencia o sobreexpresión de estos genes, respectivamente. Otro protocolo de terapia génica in vivo consiste en la inyección directa en lesiones de melanoma de un vector que codifica para el IFN-7.
Sin duda, la transferencia de genes tendrá un papel fundamental en el tratamiento de muchas enfermedades. Hasta el momento, su aplicación clínica no ha logrado satisfacer las expectativas que había suscitado esta tecnología. Sin embargo, la situación actual es todavía de desarrollo y la investigación debe seguir su curso.
GENOMA HUMANO
Desde las observaciones iniciales de Mendel en el siglo pasado hasta el conocimiento actual detallado de un considerable número de genes y de sus alteraciones moleculares, se ha producido un progreso exponencial en la comprensión de los mecanismos moleculares más íntimos del funcionamiento del organismo humano. Los avances en la metodología del análisis molecular han marcado el ritmo de los descubrimientos científicos en algunos campos de la medicina y de sus aplicaciones al diagnóstico médico. El análisis cromosómico mediante la hibridación in situ fluorescente, el descubrimiento de las enzimas de restricción, el desarrollo del Southern blotting, la construcción de genotecas específicas de cada cromosoma humano y de genotecas de DNA complementario (cDNA) de distintos tejidos a partir del RNA mensajero (mRNA), el desarrollo de métodos para el análisis de la secuencia de nucleótidos del DNA, el descubrimiento de la utilidad de los RFLP y de los microsatélites en el estudio del genoma humano, han permitido descubrir los genes de muchas enfermedades, facilitando su diagnóstico y su prevención e incrementando el conocimiento sobre su fisiopatiología.
La complejidad del material genético del hombre (genoma humano) se refleja en la enorme información que contiene. El material genético de una célula haploide humana tiene tres mil millones de pares de bases (pb), que se encuentran organizados en los 23 cromosomas. Las células normales son diploide y, por lo tanto, tienen 46 cromosomas. En la actualidad se sabe muy poco sobre la información de este material genético. El número de genes mapeados es de unos 5.000, que representan el 5-10 % del total de genes humanos, calculado en unos 50.000 a 100.000 genes. El estudio del genoma humano debe conducir a localizar todos los genes de cada cromosoma y a determinar la totalidad de la secuencia de nucleótidos del material genético del hombre.
Durante los últimos 10 años se han identificado y aislado los principales genes de las enfermedades hereditarias. Esto ha sido posible mediante al empleo de una nueva metodología de análisis genético y molecular denominada clonación posicional, que consiste en aislar un gen sobre la base de la posición que éste ocupa en el genoma y en el cromosoma en el que está localizado. En la mayoría de los casos no se conoce la localization cromosómica al principio de la investigación y sólo se parte de familias con varios miembros afectados por la enfermedad que se estudia. En otros casos, el punto de partida lo constituyen alteraciones cromosómicas que indican el lugar donde debe estar localizado el gen que se quiere identificar. En ambas situaciones se aislan fragmentos de material genético de la región en donde se encuentra el gen, se los identifica y se determina la secuencia de los genes candidatos de esa región; luego se buscan las alteraciones genéticas en ellos, hasta dar con el responsable de la enfermedad de la que se partió y se deduce la función de la proteína para la cual el nuevo gen lleva información.
El método de clonación posicional ya ha permitido localizar más de 500 genes responsables de patologías con base genética, de los cuales más de 75 han sido identificados y caracterizados. La identificación de los genes causantes de enfermedades como la ñbrosis quística, la corea de Huntington, la neurofibromatosis tipos 1 y 2, la poliquistosis renal del adulto, la distrofia miotónica, el cáncer de mama, el cáncer de colon, la enfermedad de Alzheimer, entre otras, se ha realizado mediante el empleo de esta metodología y ha abierto enormes perspectivas en el terreno del diagnóstico, el conocimiento médico y la terapéutica. La identificación de la totalidad de los genes humanos y el estudio de su participación en los procesos patológicos cambiarán de manera radical la medicina a partir de las próximas décadas.
MAPAS DEL GENOMA HUMANO
Para orientar la búsqueda de genes en la complejidad de la información molecular del material genético es necesario emplear distintos tipos de mapas. Éstos se clasifican en: físico, genético, de enfermedades, de genes y de secuencia.
Mapa físico
El mapa físico del genoma es la base para la caracterización de todos los genes y para la determinación de la totalidad de la secuencia del genoma. Desde el punto de vista citogenético éste puede considerarse organizado en los distintos cromosomas y su estructura se mide en unidades de DNA (1 kb = 1.000 nucleótidos o pares de bases). A nivel cromosómico la hibridación in situ fluorescente (HISF) permite localizar cualquier fragmento de DNA clonado en los cromosomas en metafase.
Las anomalías cromosómicas pueden indicar la localization cromosómica de los genes involucrados en fenotipos determinados. En el caso de la distrofia muscular de Duchenne, la neurofibromatosis tipo 1 (Von Recklinghausen), la esclerosis tuberosa o la poliquistosis renal del adulto, los casos excepcionales de translocaciones cromosómicas permitieron aislar y caracterizar los genes participantes en estas afecciones. Por otra parte, los casos de alteraciones cromosómicas permiten ordenar en el cromosoma genes o fragmentos de DNA, lo que contribuye al mapa físico de cada cromosoma.
Existen sistemas especiales de separación de las moléculas del DNA, como la electroforesis de geles en campos pulsantes (PFGE), que constituyen el segundo nivel en la construcción de los mapas físicos del genoma. Este sistema cubre el vacío entre la citogenética y los métodos clásicos de análisis molecular y tiene una resolución de entre 50 kb y 10 megabases (Mb). Las enzimas de restricción permiten establecer puntos de referencia de la estructura del genoma que llevan a un mapa físico de restricción. Por otra parte, los cromosomas artificiales de levadura (YAC) hacen posible insertar fragmentos de DNA de gran tamaño. Los YAC permiten disponer de la totalidad del genoma en sólo pocas decenas de miles de clones y facilitan la construcción de mapas continuos de cada cromosoma.
La totalidad del material genético de un organismo, o parte de este material, puede perpetuarse en vectores (plásmidos, cósmidos o bacteriófagos) que se propagan en bacterias. Los clones que contienen los fragmentos de DNA de regiones determinadas del genoma pueden analizarse estudiando las zonas de solapamiento y obtener así mapas continuos de clones.
Desde el punto de vista de la complejidad, los mapas de solapamiento de clones pueden ser de YAC, de cromosomas bacterianos artificiales (BAC), cósmidos, bacteriófagos y plásmidos.
El desarrollo de la metodología de la PCR y la secuenciación de fragmentos del genoma ha permitido desarrollar un nuevo concepto de unidad física de mapeo, definida por los sitios identificados por una secuencia (STS), que son secuencias marcadoras de referencia en la construcción de los mapas físicos de solapamiento de clones. Uno de los objetivos del Proyecto Genoma es obtener un marcador cada 100 kb (30.000 STS para la totalidad del genoma).
Aunque los primeros mapas obtenidos fueron los de los cromosomas 21 e Y, en la actualidad existen mapas de STS y de YAC solapantes para cada cromosoma. El paso siguiente es la transformación de los mapas de YAC en mapas de BAC y cósmidos para proceder a la secuenciación completa del genoma. Se calcula que en el caso del cromosoma 21, estará secuenciado en su totalidad antes del año 2000; para la totalidad del genoma se ha establecido como fecha tope el año 2005.
Mapa genético
Los mapas genéticos constituyen una herramienta esencial para la localization e identificación de genes, especialmente aquellos implicados en enfermedades de causa genética. La calidad (informatividad) y densidad de los marcadores determinan el poder y la utilidad de estos mapas. Se los construye sobre la base de la distancia genética determinada por la frecuencia con que se producen recombinaciones meióticas o crossover entre dos loci. La distancia entre loci está definida por el índice de recombinación (q). El ligamiento genético se evalúa mediante la cosegregación de marcadores a través de varias generaciones. Los loci pueden ser un marcador genotípico (un RFLP o un microsatélite) o un marcador fenotípico (una enfermedad).
La unidad de medida de la distancia genética es el Morgan o unidad de recombinación. La longitud total del genoma humano haploide se estima en 30 Morgans. Si se considera que la longitud física del genoma humano es de 3.000 millones de nucleótidos, 1 Morgan equivale a 100 millones de nucleótidos y 1 centiMorgan (cM), a 1 millón de bases.
El análisis de ligamiento se basa en la valoración de la fracción de recombinación, q, y en probar si una observación determinada es significativamente inferior al 50 %. Se utiliza el logaritmo decimal de esta fracción, que se conoce como lod score Z (9) = log10 [(L (9) / L (005)]. Si el Z (9) máximo es igual a 3 o superior se habla de ligamiento, mientras que si el lod score es inferior a 2 se puede excluir el ligamiento entre los loci. En la localization de un gen, las recombinaciones entre loci permiten establecer el orden de los marcadores en relación con la enfermedad.
Los microsatélites son los mejores marcadores para el análisis genético; el elevado grado de variabilidad de estas secuencias, con heterocigosidades superiores al 70 %, hace de ellas herramientas ideales para la construcción de mapas genéticos. Existen más de 6.000 microsatélites CA/GT, que cubren más del 95 % del genoma. El estudio de estos marcadores en 40 familias de referencia formadas por muchos miembros ha permitido obtener un mapa genético de gran saturación, suficiente para los proyectos de clonación positional. Este mapa tiene una densidad de un marcador cada 0,7 cM, que permite el mapeo de enfermedades hereditarias raras y de enfermedades genéticas complejas. El mapa genético del ratón es también muy interesante, y existe ya un mapa con más de 6.000 marcadores.
Mapa de enfermedades
Una enfermedad puede emplearse como un marcador en estudios de ligamiento genético, lo cual permite localizar los genes de enfermedades como la corea de Huntington, la poliquistosis renal del adulto, la fibrosis quística, la poliposis colónica familiar, el melanoma familiar, las ataxias hereditarias, las neurofibromatosis y el cáncer de mama.
El número de defectos genéticos determinados en el hombre se ha incrementado de manera considerable en los últimos años; en la actualidad se conocen más de 6.000 defectos hereditarios. Los genes responsables de muchas de estas enfermedades ya han sido localizados en el genoma, en algunos casos conociendo el gen específico que interviene en la enfermedad, y en otros, en forma indirecta, mediante marcadores ligados al defecto. El mapa genético del hombre tiene un interés cada vez mayor para la investigación biomédica. La localization de una enfermedad en el genoma es el paso fundamental para el aislamiento del gen responsable y para el avance en el conocimiento de esa afección. Los genes relacionados con las enfermedades hereditarias más graves ya fueron mapeados y muchos de ellos identificados y aislados, lo que permitió estudiar su patología molecular, celular y bioquímica. Existen varios ejemplos del rápido avance en el conocimiento de los procesos patológicos neuromusculares, cardíacos y neurodegenerativos a partir de un mejor conocimiento del mapa de estas enfermedades.
Mapa de genes
Se calcula que existen entre 50.000 y 100.000 genes en el genoma del hombre. El conocimiento actual es todavía muy limitado, ya que hay unos 10.000 genes acerca de los cuales se tiene sólo una información parcial y únicamente 5.000 de ellos han sido localizados en el mapa genético. Uno de los aspectos del genoma humano que ha despertado mayor interés es la caracterización parcial de secuencias codificantes (cDNA) o secuencias marcadoras expresadas (EST). Varios laboratorios y empresas farmacéuticas han iniciado la secuenciación masiva de EST y se habían identificado 270.000 a finales de 1995; se calcula que al final del proyecto se secuenciarán en total 500.000 EST.
Estas EST se están analizando desde distintas perspectivas. Primero, se las localiza en el genoma en el mapa físico de YAC. En segundo lugar, se llevan a cabo estudios de expresión mediante el análisis de RNA de distintos tejidos. Por último, se procede al análisis de la secuencia completa de los genes de los cuales forman parte estas EST.
Mapa de secuencia
El objetivo final del Proyecto Genoma es la obtención de la secuencia completa del material genético. Los mapas físico, genético, de enfermedades y de genes constituyen la información necesaria para determinar las prioridades y las bases del desarrollo del mapa de secuencia del genoma humano. En primer término, el mapa físico y genético determina los puntos de referencia para disponer de los clones para la secuenciación. Segundo, los genes y sus secuencias parciales constituyen puntos clave desde donde puede iniciarse parte del estudio de secuencia. Finalmente, las enfermedades suponen una prioridad desde el punto de vista de los esfuerzos iniciales de secuenciación del proyecto. De este modo, la estructura genómica de los genes de la corea de Huntington, la poliquistosis renal del adulto y otras enfermedades ha sido secuenciada en su totalidad.
PROYECTO GENOMA HUMANO
A finales de 1990 se inició en Estados Unidos un proyecto científico encaminado a descubrir la totalidad de la información genética del hombre. El Proyecto Genoma pretende poner al alcance de la investigación biomédica la totalidad de la información de nuestros genes. El proyecto deberá finalizar en el año 2005. Durante los primeros 5 años del Proyecto Genoma se ha realizado un enorme progreso en todos y cada uno de sus aspectos. Más de 15 países se han unido al proyecto y realizan contribuciones en distintos niveles. La financiación global anual de este proyecto es de unos 400 millones de dólares.
La información generada por el Proyecto Genoma está creciendo en forma extraordinaria. Esta información se almacena rápidamente en bases de datos que están a disposición de todos los investigadores. El sistema World Wide Web (WWW) facilita la comunicación entre los investigadores y el acceso a la información sobre distintos aspectos del Proyecto Genoma. Esto permite acceder a información sobre enfermedades, secuencias de DNA, proteínas, polimorfismos, clones de YAC, BAC, cósmidos y EST. La mayoría de las bases de datos del estudio del genoma humano (GDB, GSDB, SWISS-PROT, PROSITE, BLOCKS, PRODOM, MGD, TBASE, FlyBase, OMIM, MEDLINE, Medline Entrez) están relacionadas entre sí, y se puede acceder a ellas desde las páginas WWW de los principales centros de investigación.
El enorme aumento en la información y el conocimiento científico que proporciona el Proyecto Genoma hace que sea necesario garantizar la privacidad y el derecho de cada persona a ser la auténtica propietaria de la información genética que se obtenga con finalidades médicas. Esto tiene especial importancia en países como Estados Unidos, donde las compañías de seguros pueden no admitir a un cliente si éste no aporta información sobre determinadas enfermedades de base genética. Por otra parte, la facilidad tecnológica de los estudios geneticomoleculares pone al alcance de profesionales sin ninguna formación genética el análisis de enfermedades tan complejas como la corea de Huntington o las enfermedades psiquiátricas, para las que se debe contar con un encuadre ético y médico adecuado.
El conocimiento sobre el genoma proporcionará una información de enorme importancia biológica, que no podría alcanzarse por otros medios. Este conocimiento permitirá avanzar en el estudio y tratamiento de las enfermedades hereditarias, el cáncer y las enfermedades multifactoriales, entre las que se encuentran la mayoría de los procesos comunes que afectan al hombre: hipertensión, aterosclerosis, malformaciones congénitas, asma, diabetes y enfermedades psiquiátricas. La información generada por el Proyecto Genoma será empleada por miles de investigadores interesados en procesos específicos. La ciencia médica del futuro dependerá de esta información para entender las enfermedades, para su diagnóstico y para su tratamiento.
