En los últimos 20 años se han producido avances técnicos cuyo impacto ha sido fundamental para el análisis genético. En consecuencia, el conocimiento de los mecanismos moleculares que intervienen en los procesos normales y patológicos ha progresado vertiginosamente y comienza a influir en la práctica de la medicina actual.
Los avances en patología molecular constituyen ya una parte importante de los artículos publicados en prestigiosas revistas médicas generales y su comprensión requiere un mínimo conocimiento de las tecnologías moleculares utilizadas.
Dado que estas técnicas comienzan a aplicarse en forma sistemática y que sus resultados pueden tener implicaciones importantes en el abordaje clínico de los pacientes, es esencial conocerlas someramente y tener conciencia de algunas de sus limitaciones.
Las técnicas de análisis de los ácidos nucleicos se fundamentan en la complementariedad de las bases que los constituyen (adenina, timina, citosina, guanina y uracilo). La especificidad de la interacción A:T y G:C condiciona las reacciones de hibridación de los ácidos nucleicos. Es importante destacar que la naturaleza de estas dos interacciones es químicamente distinta, pues A:T se unen por dos puentes de hidrógeno, mientras que G:C lo hacen por tres y la energía de la interacción es, por lo tanto, más alta para G:C.
Las técnicas de hibridación de los ácidos nucleicos, en el sentido más amplio de la expresión, permiten analizar la secuencia de un fragmento de DNA, diferenciarlo de otro al que se parece mucho, determinar la presencia de secuencias más o menos similares en una preparación de DNA o RNA e incluso en una preparación tisular, proporcionando información discreta sobre la célula en la que se halla esa secuencia de ácido nucleico. Se debe destacar que, si bien la interacción de una hebra de un ácido nucleico con otra requiere la complementariedad de sus secuencias, las condiciones de hibridación pueden ser más o menos estrictas (astringentes, en la jerga habitual) y permitir la detección de secuencias que sean idénticas o semejantes, respectivamente.
Aunque todas las técnicas de análisis de los ácidos nucleicos se basan en la especificidad de su hibridación, la descripción que se realizará en este capítulo estará dividida en dos partes: la primera se referirá más propiamente a aquellas técnicas que se basan en la hibridación de los ácidos nucleicos como método de detección, y la segunda, a las diferentes aplicaciones de las técnicas de amplificación de los ácidos nucleicos, cuyo impacto en el análisis molecular ha sido espectacular.
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Electroforesis e hibridación sobre filtro
Esta técnica puede aplicarse a la detección de DNA (Southern blotting) o RNA (Northern blotting). La preparación de los ácidos nucleicos se fracciona por electroforesis en geles de agarosa y posteriormente aquéllos se transfieren a un filtro, por lo general de nitrocelulosa o nilón. Después de ser inmovilizados sobre el filtro por medio de la acción del calor o la luz ultravioleta, pueden hibridarse con una sonda (DNA o RNA) marcada. Para marcar la sonda pueden incorporarse isótopos radiactivos o moléculas no radiactivas, como la biotina o la digoxigenina. La ventaja de estas últimas es que no requieren condiciones especiales de manipulación y pueden reutilizarse más fácilmente. La sonda marcada híbrida sobre el filtro con aquellos fragmentos de ácido nucleico que son complementarios. Las condiciones de astringencia de los lavados permitirán detectar secuencias estrictamente complementarias u homologas. El revelado de la hibridación depende del método de marcación que se utiliza (p. ej., autorradiografía, técnicas inmunoen-zimáticas). Esta técnica tiene la ventaja de ser semicuantitativa y proporcionar información sobre el tamaño del ácido nucleico complementario a la sonda.
Una variedad de esta técnica es la que se conoce como electroforesis de geles en campos pulsantes (PFGE), para el análisis de ácidos nucleicos de gran tamaño (50-3.000 kb).
Hibridación sobre los tejidos
Esta técnica se conoce habitualmente como hibridación in situ (HIS) y es adecuada para identificar las células que contienen secuencias de ácidos nucleicos complementarias a las sondas utilizadas. Puede utilizarse para detectar tanto DNA como RNA. Si bien es relativamente poco sensible, permite identificar una baja proporción de células que contienen la secuencia de interés en un fragmento de tejido en el cual la mayoría de las células no la contienen. En el caso del DNA, suele utilizarse para la detección de secuencias víricas (p. ej., papilomavirus). Con frecuencia se la emplea para la detección de RNA. Una ventaja de la HIS sobre las técnicas inmunohistoquímicas que utilizan anticuerpos para detectar una proteína es que permite identificar las células que sintetizan el RNA y, por consiguiente, la proteína, mientras que las técnicas inmunohis-toquímicas pueden detectar células que hayan internalizado una proteína producida por otras células.
Para la detección de DNA por HIS es posible utilizar material parañnado de archivo, mientras que la detección de RNA requiere material exquisitamente preservado y que ha sido procesado inmediatamente después de su resección. Esto es consecuencia de la ubicuidad de las RNAsas.
A diferencia de los procedimientos de hibridación sobre filtros, la HIS no permite distinguir fácilmente entre los ácidos nucleicos cuya secuencia es estrictamente complementaria a la de la sonda utilizada y otros que muestren un alto grado de identidad. Recientemente se han desarrollado técnicas de HIS asociadas a la amplificación de ácidos nucleicos.
Hibridación sobre cromosomas
Con la técnica de HIS pueden localizarse sobre preparaciones de cromosomas las secuencias complementarias a las de la sonda utilizada. Al igual que en las técnicas que se describieron anteriormente, pueden emplearse métodos radiactivos o no isotópicos. En general se utilizan células que se hallan en metafase, si bien los métodos desarrollados recientemente permiten la hibridación a núcleos de células en interfase. La técnica permite la localization cromosómica de un gen. También puede usarse para caracterizar reordenamientos o alteraciones en el número de cromosomas, sobre todo en la citogenética del cáncer.
La hibridación genómica comparada permite identificar regiones amplias del DNA delecionadas, o amplificadas, en células tumorales.
TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Uno de los desarrollos técnicos más espectaculares de los últimos 10 años ha sido el de las técnicas de amplificación del DNA. En general consisten en la síntesis enzimática de un número muy elevado de copias de una secuencia de DNA, conocida o no. La más común es la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus variedades. Otras técnicas de amplificación de ácidos nucleicos se utilizan menos pero sus aplicaciones específicas son interesantes.
Reacción en cadena de la polimerasa
El avance más importante en la aplicación sistemática de esta técnica lo constituyó la utilización para la síntesis del DNA de una DNA-polimerasa obtenida a partir de la bacteria, T. aquaticus, que es activa a temperaturas elevadas. En su variedad más convencional, la PCR consiste en la amplificación de una secuencia de DNA conocida utilizando oligonucleotidos específicos como cebadores de la reacción. Cada ciclo de la reacción consta de tres fases: a) desnaturalización de las dos hebras de DNA, que se produce a una temperatura aproximada de 95 C; b) hibridación de los oligonucleotidos a las hebras desnaturalizadas, que se produce a temperaturas entre 45-60 C según el grado de astringencia deseado, y c) síntesis, que se realiza alrededor de 72 C, temperatura óptima para la DNA-polimerasa de T. aquaticus (Taq-polimerasa). En general se realizan 30-40 ciclos de amplificación y la calidad del producto amplificado se analiza por electroforesis y/o ñibridación de los ácidos nucleicos.
La Taq-polimerasa no es perfectamente fiel y pueden producirse errores de copia (aproximadamente 3 X 10~4) que se perpetúan durante el proceso de amplificación. Por eso en los últimos años se ñan aislado otras polimerasas más fieles en la copia y que presentan ventajas adicionales, como la de tener actividad de transcriptasa inversa.
La sensibilidad de la PCR es muy alta, por lo que es posible amplificar secuencias específicas a partir del DNA de un número muy reducido de células (menos de un centenar). Pero aunque esta característica es fundamental, el uso sistemático de la técnica puede presentar considerables problemas. Entre otros, la formación de aerosoles durante la manipulación de la muestra amplificada puede provocar la contaminación de muestras en las que no se encuentra la secuencia de ácido nucleico que se quiere amplificar, dando falsos positivos. Por eso, un aspecto fundamental de la PCR es el control de calidad de los experimentos, que siempre deben incluir una o más muestras sin DNA.
La eficiencia de la reacción depende en gran medida del tamaño del segmento de DNA que se va a amplificar. Utilizando métodos convencionales, el límite es de 3 kb, si bien recientemente se ha optimizado la técnica para amplificar fragmentos de hasta 20 kb.
Entre las múltiples variedades de PCR que se han descrito hasta el momento pueden destacarse las siguientes:
1. RT-PCR (o PCR de muestras sometidas a transcripción inversa). Esta variedad se utiliza para la detección de RNA. Tiene una sensibilidad muy superior a la del Northern blotting y con frecuencia puede utilizar muestras de RNA cuya calidad no sería adecuada para éste. En primer lugar se procede a una copia del RNA a DNA utilizando la transcriptasa inversa de un retrovirus (p. ej., del ALV o del MuLV); después, el DNA se amplifica como en la reacción convencional de PCR. Recientemente se han desarrollado enzimas que tienen actividad transcriptasa inversa y DNA-polimerasa, por lo cual la reacción puede llevarse a cabo en una sola etapa. La sensibilidad de la RT-PCR es tal que puede aplicarse para la amplificación de transcritos ilegítimos (aquellos que escapan al fino control de la regulación transcripcional): por ejemplo, es posible detectar transcritos de colágeno en los leucocitos de la sangre periférica, un tipo celular que no sintetiza colágeno a niveles funcionales.
2. Alu-PCR. Se basa en la amplificación de DNA utilizando como cebadores oligonucleótidos correspondientes a las secuencias repetitivas Alu que se hallan dispersas en un gran número de copias en el genoma.
3. AP-PCR (o PCR en la que se utilizan cebadores arbitrarios). Puede llevarse a cabo en dos variedades: a) utilizando cebadores muy pequeños de alrededor de 8-10 nucleótidos y que por lo tanto confieren baja astringencia a la reacción, o b) utilizando cebadores de tamaño convencional (alrededor de 18-20 nucleótidos) y condiciones de hibridación poco astringentes (baja temperatura de hibridación) durante los primeros ciclos de la amplificación. Esta variedad de PCR se utiliza mucho en la actualidad para comparar patrones de amplificación a partir de preparaciones de ácidos nucleicos.
4. RAP-PCR. Se basa en el mismo principio que la AP-PCR, pero utiliza RNA en lugar de DNA como material de copia. Permite comparar los conjuntos de transcritos presentes en diferentes preparaciones de RNA obtenidas de distintas células o tejidos, o en diversas condiciones. Una variante de esta estrategia se conoce como differential display.
Reacción en cadena de la ligasa
En esta reacción de amplificación se usa una ligasa (enzima que une dos fragmentos de DNA contiguos) en lugar de una polimerasa. Se basa en la utilización de dos pares de oligonucleótidos sintéticos cuya secuencia es idéntica a la de la secuencia diana, fragmentada en dos segmentos adyacentes de doble hebra. La presencia de la secuencia diana permite ligar los pares de oligonucleótidos, y el producto sirve de patrón para los siguientes ciclos. En realidad esta reacción sirve para amplificar la detección de la secuencia objeto del estudio.
Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos
Esta reacción utiliza RNA como sustrato. Después de la síntesis de cDNA por la transcriptasa inversa, la RNAsa degrada la cadena patrón de RNA y un segundo oligonu-cleótido complementario permite iniciar la síntesis de otra cadena. Este oligonucleótido contiene la secuencia del promotor de una RNA-polimerasa vírica que copia el DNA a RNA, el cual sirve de templete para las siguientes reacciones.
Detección de mutaciones y polimorfismos
Las técnicas para la detección de mutaciones y polimorfismos han adquirido gran importancia en la correlación de genotipos con fenotipos, en la identificación de los genes responsables de enfermedades hereditarias, de los alelos que confieren susceptibilidad a una enfermedad y de la relación entre la estructura y la función de los productos codificados por estos genes. Para simplificar, se hará referencia exclusivamente a las mutaciones, ya que los polimorfismos son una variedad de éstas que se ha seleccionado a lo largo de la evolución.
Las estrategias técnicas utilizadas para la detección de mutaciones conocidas y las necesarias para el cribado de alelos desconocidos son distintas. El grado de complejidad de los genes en estudio también condiciona la metodología aplicada. En general, pero no siempre, interesa estudiar la presencia de mutaciones en las regiones codificantes de los genes. Si es así, puede plantearse la utilización de RNA, en lugar de DNA, como patrón para la identificación de las mutaciones, según el tamaño y la complejidad del gen que se desea analizar. Así, el gen de la distrofina contiene 80 exones, mientras que el gen SRY contiene un solo exón.
Detección de deleciones o inserciones
Cuando la alteración estructural del gen en estudio es relativamente grande (deleciones o inserciones de fragmentos de gran tamaño), el Southern blotting es de fácil y útil aplicación. La PCR múltiple también puede ser de utilidad: consiste en la amplificación simultánea de varias regiones de un mismo gen utilizando múltiples pares de oligonucleótidos. Las deleciones se ponen de manifiesto por la falta (o reducción al 50 %) de algunos de los fragmentos de amplificación predichos.
Detección de mutaciones puntuales
Un método de cribado que se utiliza con frecuencia a partir de 1989 es el análisis conformacional de ácidos nucleicos de simple hebra, los polimorfismos secuenciales de cadena sencilla (SSCP). El producto de la amplificación por PCR se desnaturaliza y se analiza por electroforesis en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Las diferencias en un solo nucleótido ocasionan cambios en la movilidad electroforética (fig. 5-4). Este método permite identificar alelos mutados pero no proporciona información sobre la localization o la naturaleza de la mutación. La eficacia de la detección de mutaciones en fragmentos de hasta 200 pb es del 70-95 %, pero disminuye rápidamente para fragmentos de mayor tamaño. La electroforesis en geles de gradientes desnaturalizantes (DGGE) también se basa en la migración diferencial de ácidos nucleicos que difieren en un solo nucleótido. En geles desnaturalizantes, el DNA de doble hebra se disocia a simple hebra y se produce una reducción de la movilidad electroforética. Una variante de esta técnica consiste en desnaturalizar los fragmentos de DNA que contienen secuencias silvestres y mutadas y permitir su renaturalización antes de la electroforesis. Los fragmentos amplificados analizados por SSCP o DGGE pueden detectarse por métodos isotópicos y no isotópicos (bromuro de etidio o nitrato de plata).
La técnica de detección de ácidos nucleicos de doble hebra no bien apareados (mismatch) consiste en la formación de heterodúplex de una sonda del RNA que corresponde a la secuencia silvestre y el DNA (generalmente amplificado por PCR) que contiene la secuencia presumiblemente mutada. En el nucleótido en el que se halla la mutación se produce un apareamiento incorrecto que es susceptible de la acción hidrolítica de la RNAsa A (RNase mismatch cleavage), o puede evidenciarse por modificación e hidrólisis química (chemical mismatch cleavage).
Cuando la mutación que se quiere detectar es conocida, un método sencillo y rápido consiste en la amplificación de DNA y la utilización de enzimas de restricción capaces de reconocer diferencialmente la secuencia silvestre y la mutada (fragmentos de restricción de longitud polimórfica [RFLP]). Cuando el sitio en el cual se presenta la mutación no es susceptible de restricción enzimática pueden utilizarse para la amplificación cebadores que introducen de manera artificial un lugar de reconocimiento por una enzima. Así, el producto de la amplificación se digiere con la enzima y las formas silvestre y mutada se distinguen por su tamaño después de la electroforesis.
Aunque los métodos descritos permiten detectar mutaciones con un grado variable de eficiencia, no proporcionan informaciones sobre la localization exacta y la naturaleza de la mutación. Éstas sólo pueden obtenerse en forma fidedigna por medio de la secuenciación del DNA, que constituye una etapa necesaria en cualquier tipo de estudio, sobre todo cuando el objetivo no es el cribado. Por lo general se denomina secuenciación directa a la aplicación de los métodos de secuencia a los productos obtenidos después de la amplificación por PCR, con la técnica de la terminación de la cadena por didesoxinucleótidos (método de Sanger) o con la técnica de secuenciación durante la amplificación o secuenciación en ciclos. Esta última técnica tiene la ventaja de que requiere cantidades muy pequeñas de DNA patrón y en ella los didesoxinucleótidos se incorporan directamente a la reacción de PCR.
Las técnicas de secuenciación directa de los productos de PCR presentan un problema: la polimerasa puede introducir errores de copia en los primeros ciclos y éstos pueden amplificarse durante la reacción. Una estrategia adicional para verificar la validez de la secuenciación directa consiste en subclonar los productos de la amplificación en un vector y secuenciar un número variable de subclones para confirmar la mutación.
Microsatélites
Los microsatélites son secuencias repetitivas cortas (de 1-3 nucleótidos) que se encuentran distribuidas a lo largo de todo el genoma, especialmente en regiones no codificantes. El número de repeticiones es variable para cada alelo y dado que existen muchos alelos diferentes, los microsatélites constituyen excelentes marcadores polimórficos de heterocigosidad (la mayoría de los individuos tienen dos alelos distintos para este tipo de secuencias de DNA).
En los últimos años el interés por los microsatélites se ha incrementado porque diversas afecciones se asocian a alteraciones en su secuencia. Por ejemplo, algunas enfermedades hereditarias se relacionan con un aumento del tamaño de las secuencias repetitivas por encima de lo normal y existe una relación entre el tamaño de éstas, la gravedad de la enfermedad y la edad a que se presenta. Un ejemplo es el síndrome del cromosoma X frágil. En esta forma de retraso mental se hereda un trinucleótido CGG repetitivo inestable adyacente a regiones ricas en CG en la región 5' del gen FMR1. Los individuos normales tienen entre 2 y 50 copias de CGG, mientras que los enfermos muestran hasta 200 copias. Otras enfermedades asociadas con la inestabilidad de los microsatélites son la distrofia miotónica, la atrofia muscular bulbar espinal ligada al sexo y la enfermedad de Huntington. Otro ejemplo es el síndrome de Lynch, que comprende el cáncer colorrectal hereditario no polipoide, en el que se producen alteraciones en la reparación de los apareamientos incorrectos del DNA. En los pacientes con este síndrome, uno de los alelos que codifica para una enzima reparadora está mutado en todas las células del organismo y una segunda mutación en las células somáticas puede dar lugar a una alteración grave de los mecanismos de reparación y a la progresión neoplásica.
