ALGUNAS NOCIONES GENERALES SOBRE LAS VÍAS DE TRANSMISIÓN DE LAS SEÑALES EXTRACELULARES
La evolución de los organismos multicelulares depende de la capacidad que tienen sus células para intercomunicarse. En el capítulo anterior se describieron en detalle algunos de los factores que el organismo utiliza como mensajeros extracelulares y se indicó cómo la mayoría de estas sustancias no penetran en el interior de la célula sino que inician su acción uniéndose a receptores específicos situados en la membrana celular. Un tema que suscita cada vez más interés es el estudio de cuáles son las señales intracelulares que se disparan después de la activación de un receptor por su ligando y cómo la estimulación de estas señales conduce al efecto final del mensajero extracelular, sea cual fuere. Este conjunto de reacciones, que hasta hace muy poco tiempo constituía una gran caja negra, suele denominarse vías de transmisión o transducción de la señal hormonal.
Antes de comenzar a analizar las vías de transmisión más relevantes, conviene aclarar algunos conceptos básicos.
Tipos de efectores extracelulares
Originariamente las vías de transmisión de señal más estudiadas eran las activadas por hormonas, factores de crecimiento o neuropéptidos. En los tres casos se trata de compuestos de pequeño tamaño, lo que facilitó la identificación de sus receptores. Sin embargo, existen otros efectores mucho más complejos que también generan señales intracelulares muy importantes, en algunos casos comunes a las de ciertas hormonas y factores de crecimiento. A continuación se describen tres de ellos de especial relevancia.
Señales generadas por la interacción directa célula-célula. Se trata de un campo de interés potencial muy elevado, dado que muchas células dejan de dividirse después de establecer contacto con otras células del mismo tipo. Las proteínas que participan en esta inhibición del crecimiento por contacto son en su mayoría desconocidas, así como lo es el mecanismo que utilizan para transmitir al interior de la célula este efecto. En cambio, en otros tipos de células, como los linfocitos, la proliferación se incrementa después de su interacción directa con células efectoras.
Señales inducidas después de la interacción con proteínas de la matriz extracelular. Se sabe que un requisito fundamental para el crecimiento de las células adherentes es su unión a la matriz extracelular. Esta interacción, que se lleva a cabo a través de proteínas específicas conocidas como integrinas, induce la generación de señales intracelulares que guardan analogía con las disparadas por los factores de crecimiento.
Señales inducidas por la unión de bacterias a células diana no macrofágicas. Gran parte de las células del tracto gastrointestinal pueden ser invadidas por bacterias, como por ejemplo Salmonella typhimirium, que utilizan sistemas específicos de entrada. Después de la unión, ciertas proteínas bacterianas generan la transmisión de una señal al interior de la célula que origina cambios en la estructura del citoesqueleto y la formación de vesículas que internalizan a dichas bacterias. En la actualidad se están identificando estas señales intracelulares con el propósito de bloquear las vías de penetración bacteriana y de lograr, por lo tanto, un posible beneficio terapéutico.
Efectos finales
Las vías de transmisión celular pueden estar ligadas a efectos finales de naturaleza muy variada. En principio, ciertas vías han suscitado mayor interés porque estaban relacionadas con un efecto final característico, fácil de medir y de potencial importancia clínica; éste es el caso de las vías involucradas en el control de la proliferación celular por mitógenos. Sin embargo, en la actualidad se han comenzado a identificar mediadores que se asocian con otros efectos diversos como, por ejemplo, la diferenciación de células pluripotenciales o las alteraciones del citoesqueleto. Es importante destacar que las señales inducidas por un determinado efector pueden ser específicas de la célula diana; es decir, factores que en un determinado tipo de células actúan como mitógenos (activadores del crecimiento) en otro pueden inhibir su proliferación.
Especificidad de las vías de transmisión de señal
Algunos factores de crecimiento producen en sus células diana procesos muy complejos, como la activación del crecimiento o la diferenciación terminal. En estos casos el método de estudio utilizado ha consistido en descomponer el proceso en pasos que pudieran analizarse y relacionarse fácilmente con la activación del receptor. Pero, y esto es sorprendente, en muchos casos estas respuestas tempranas son poco específicas y pueden ser inducidas por factores cuya respuesta final va a ser antagónica. Un caso relevante se produce en ciertas células preneuronales en las que los factores de crecimiento EGF o NGF activan, respectivamente, la proliferación o la diferenciación terminal, es decir, dos procesos contrarios. Podría suponerse que ambos factores deberían activar señales intracelulares diferentes después de unirse a sus receptores, ya que el efecto final es tan distinto. Sin embargo, gran parte de las señales tempranas, fáciles de medir (p. ej., la activación de ciertas pro-teincinasas), son compartidas por ambos estímulos. Este problema de falta de especificidad de las respuestas intracelulares, probablemente consecuencia de que el conocimiento de la interrelación de las señales intracelulares todavía es limitado, es algo que debe tenerse en cuenta cuando se analicen las vías de transmisión de la señal después de un determinado estímulo.
SEGUNDOS MENSAJEROS: NATURALEZA Y MECANISMO DE ACCIÓN
El nombre de segundos mensajeros se ha aplicado a una serie de compuestos de pequeño tamaño y naturaleza muy variada, cuya concentración se incrementa muy rápidamente en el citoplasma celular como resultado de la acción de diversas hormonas o factores de crecimiento. A continuación se mencionan los segundos mensajeros más importantes, indicando someramente su modo de acción.
AMP cíclico. Proteínas G
El nucleótido AMP cíclico (cAMP) fue históricamente el segundo mensajero que se identificó en primer lugar. Incrementos en la concentración citosólica de cAMP son producidos por muchas hormonas prácticamente en todas las células. Un ejemplo muy estudiado es la adrenalina, que afecta tejidos como el muscular y el adiposo o el corazón, activando la glucogenólisis, la lipólisis o la aceleración de la frecuencia cardíaca, respectivamente. Todos estos efectos de la adrenalina son mediados por incrementos en la concentración citosólica de cAMP, debidos a la activación de la enzima que lo sintetiza a partir de ATP, la adenilciclasa.
Generación del cAMP: papel de las proteínas G
La activación de la adenilciclasa después de la unión de la adrenalina a su receptor es un proceso complejo, mediado por una proteína que presenta afinidad por nucleótidos de guanidina (GTP o GDP), denominada proteína G. Los receptores de compuestos de la familia de la adrenalina son proteínas de membrana, que la atraviesan 7 veces y por eso se denominan receptores de tipo serpentina; poseen también un dominio citosólico que interacciona con las proteínas G. La asociación con el receptor provoca la activación de la subunidad a de la proteína G y seguidamente la estimulación de la adenilciclasa, de acuerdo con el esquema que se indica en la figura. Existen otros miembros de la extensa familia de las proteínas G que ejercen un efecto inhibidor de la adenilciclasa. Estas proteínas contienen variantes de la subunidad a, denominadas a, (inhibidoras) por contraste con las o¿s (estimulantes); la interacción de at con la adenilciclasa bloquea la actividad de esta enzima. Debe destacarse que las proteínas G son el blanco de la acción de ciertas toxinas bacterianas como la toxina colérica, que modifica covalentemente por ADP. ribosilación la subunidad a. La subunidad a modificada no es capaz de hidrolizar el GTP y por lo tanto, queda fijada en su conformación activa, causando la estimulación persistente de la adenilciclasa.
Mecanismo de acción del cAMP
Los efectos intracelulares del cAMP se basan en su capacidad de unirse y activar una proteincinasa denominada proteincinasa dependiente del cAMP (PKA). Esta enzima es un tetrámero que consta de dos subunidades C, donde radica la actividad catalítica, y dos R o reguladoras: la unión del cAMP al dímero R2 supone la liberación de las dos subunidades C y su activación. La PKA tiene un amplio espectro de sustratos que participan tanto en el control del crecimiento celular como en respuestas metabólicas más inmediatas. Probablemente los efectos del cAMP más estudiados son los que lo relacionan con la degradación del glucógeno. Desde hace tiempo se sabe que las hormonas que incrementan la síntesis de cAMP promueven la liberación de glucosa a partir de su polímero de reserva, el glucógeno. Este efecto está mediado por la PKA, que fosforila enzimas involucradas tanto en el control de la síntesis como en el de la hidrólisis de este polímero, tal como se indica.
El efecto del cAMP sobre la degradación del glucógeno no se ejerce en forma directa sino a través de una reacción de fosforilación en cadena. Esta cascada de fosforilaciones es relativamente común en las vías de transducción de la señal; se da en mucho mayor extensión en las reacciones que conducen al control del crecimiento celular, como se verá más adelante. Se ha sugerido que su utilidad radica en que ofrece un método sencillo de amplificar una señal; es fácil de entender que el número de sustratos fosforilados después de la activación de una cinasa será mucho mayor si ésta es capaz de activar muchas otras. Pero además de amplificación, las reacciones en cadena ofrecen más versatilidad en cuanto al número de productos y a su regulación después de la acción de una hormona. El número de productos resultado de la activación de una cinasa será mucho mayor si ésta, sea en forma directa o indirecta, transmite su acción a un elevado número de efectores diferentes; también existirá una mayor posibilidad de que los efectos de la hormona sean potenciados o inhibidos por otros efectores.
Un buen ejemplo de reacción de amplificación lo constituye la estimulación por adrenalina de la liberación de glucosa en la sangre a partir del hígado. La concentración de la hormona necesaria para producir este efecto es del orden de 10~10 M. Una vez estimulada la adenilciclasa, la concentración intracelular de cAMP alcanza el valor de 10~6 M; además, como se necesitan tres pasos más antes de la liberación de glucosa, la señal se amplifica 104 veces más y la concentración de glucosa en sangre puede incrementarse hasta el 50%.
La degradación del cAMP es catalizada por una enzima denominada cAMP-fosfodiesterasa que, a su vez, depende de otro segundo mensajero, el ion Ca++. Las elevaciones intracelulares de calcio producen una activación de esta enzima y la degradación del cAMP. Este hecho indica la compleja interrelación entre los niveles de segundos mensajeros, lo que provoca que los incrementos en estos compuestos sean normalmente de muy corta duración.
Además del cAMP existe otro nucleótido cíclico que funciona como segundo mensajero: el GMP cíclico (cGMP). El cGMP es sintetizado por una guanilciclasa, una enzima cuya estructura y regulación son bastante diferentes de las de la adenilciclasa. El cGMP, como el cAMP, funciona activando una proteincinasa; sin embargo, su papel como segundo mensajero es mucho más restringido; únicamente se han mostrado incrementos en este compuesto en procesos muy específicos, como la relajación muscular o la acción de ciertos neurotransmisores.
El ion Ca++ como segundo mensajero
El ion Ca++ es otro de los segundos mensajeros cuyo estudio ha recibido mayor atención. La concentración de este ion en el citosol es del orden de 10~7 M, más de 1.000 veces menor que la existente en el espacio extracelular o en ciertas organelas celulares, como la mitocondria o el retículo endoplásmico. Esta gran diferencia de concentraciones se mantiene por la actividad de unas enzimas llamadas bombas de Ca++, que expulsan el Ca++ del citosol utilizando como motor ATP (de ahí su nombre de ATPasa-Ca++). También influye en la baja concentración de Ca++ libre en el citosol la presencia de proteínas con una elevada afinidad por este ion y que actúan como agentes quelantes.
Cambios en la concentración citosólica de Ca++. Papel del inositoltrífosfato
Existe un heterogéneo conjunto de sustancias que pueden incrementar la concentración citosólica de Ca++ de sus células diana hasta 10~5 M, es decir, unas 100 veces sobre el nivel basal. El mecanismo que se usa con más frecuencia consiste en abrir canales de calcio, normalmente inactivos,que funcionan facilitando la entrada de este ion al citosol, a partir del retículo endoplásmico o del espacio extracelu-lar. Aunque los detalles de este proceso no están bien definidos, se sabe que en muchos casos está mediado por ino-sitol-l,4,5-trifosfato (IP3), un compuesto generado después de la hidrólisis por una fosfolipasa C del fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2), un glucolípido presente en la cara interna de la membrana. Los compuestos que producen la liberación de Ca++ del retículo causan previamente la activación de la fosfolipasa que actúa sobre el PIP2 y la generación de IP3. Se ha sugerido que el receptor de este IP3 inte-racciona directamente con los canales de Ca++ del retículo endoplásmico o de la membrana plasmática.
Debe destacarse que la concentración de Ca++ dentro de una misma célula está extraordinariamente bien regulada, tanto en el aspecto espacial como en el temporal. Al utilizar reactivos fluorescentes específicos para este ion se ha encontrado que los incrementos en la concentración de Ca++ se propagan en forma de ondas en células musculares o en huevos fecundados. Se ha tratado de explicar este hecho suponiendo que existen diferentes compartimientos de Ca++, sensibles y no sensibles a IP3, repartidos en una célula; después de la liberación de Ca++ en uno de ellos, se iría produciendo una apertura paulatina de los demás, en un proceso catalizado por el propio incremento de Ca++. También es notable la existencia de una regulación temporal muy fina; en muchos tipos de células aparecen en respuesta a IP3 variaciones de la concentración de Ca++ semejantes a dientes de sierra, es decir, transitorias y repetidas.
Proteínas reguladas por Ca++: calmodulina
Existe un buen número de enzimas cuya actividad requiere Ca++. Más adelante se mencionarán algunas que participan en la generación o en el metabolismo de segundos mensajeros; con respecto a esto, ya se ha señalado que la cAMP-fosfodiesterasa se activa por este ion. En un elevado porcentaje de los casos, este requerimiento está mediado por una proteína denominada calmodulina (CaM). La CaM es una proteína de pequeño tamaño, extraordinariamente abundante en la célula (constituye aproximadamente el 1 % de la proteína celular total) y capaz de unir hasta 4 iones Ca++ por molécula. Después de la unión de este ion la CaM experimenta un cambio conformacional que le permite activar enzimas muy variadas. En algunos casos la CaM ya está asociada con el resto de las subunidades enzi-máticas y la unión de Ca++ provoca un cambio alosterico y la activación de la subunidad catalítica; en otros, la unión del Ca++ a la CaM permite su asociación con las proteínas blanco. La actividad de las enzimas dependientes de CaM es muy heterogénea: entre ellas se encuentran, por ejemplo, la cAMP-fosfodiesterasa, la proteincinasa de la cadena ligera de la miosina y la óxido nítrico-sintetasa (NO-sintetasa).
Existen otras reacciones enzimáticas dependientes de Ca++ que no están mediados por la CaM. En estos casos suele tratarse de enzimas que requieren Ca++ para unir el sustrato o algún cofactor imprescindible para su actividad.
Las variaciones en la concentración citosólica de Ca++ influyen en la actividad de enzimas que participan prácticamente en todas las vías de transducción de la señal importantes. En muchos casos, estas variaciones por sí solas no son suficientes para producir el efecto final, pero cooperan de manera sinérgica con otros estímulos externos. Ésta es una de las razones por las cuales la homeosta-sia de este ion es tan fina. Además hay que tener en cuenta que las alteraciones en la regulación de la concentración de Ca++ pueden tener como consecuencia la muerte celular. Una elevación prolongada de Ca++ origina, a través de la activación de la fosfolipasa A2 o de la NO-sintetasa, la generación de peróxidos, productos muy tóxicos e implicados en la muerte celular que subyace a ciertas enfermedades neurodegenerativas.
Diacilgliceroles y proteincinasa C
Se ha indicado anteriormente que una de las respuestas comunes a los factores de crecimiento y a los neurotrans-misores es la activación de una fosfolipasa C que actúa sobre el PIP2 liberando IP3. El otro producto de esta reacción, el diacilglicerol (DAG) también desempeña un papel importante en la transmisión de la señal hormonal, como activador de una familia de enzimas denominadas colectivamente proteincinasa dependiente de Ca++ y fosfolípidos o proteincinasa C (PKC). A pesar de su nombre, no todos los miembros de la familia PKC requieren Ca++ para su activación. Este hecho tiene importancia porque el DAG también puede generarse a partir de otros fosfolípidos diferentes del PIP2, por ejemplo, por hidrólisis de la fosfatidilcolina. En este caso no se produce IP3 y, en consecuencia, no hay movilización de Ca++, con lo cual las PKC dependientes de este ion no son activadas. Se ha sugerido que los incrementos del DAG procedente de la hidrólisis del PIP2 conllevarían la activación de las formas de PKC dependientes de Ca++, mientras que la aparición de DAG proveniente de fosfatidilcolina, un proceso que ocurre normalmente de una manera más lenta después del estímulo hormonal, causaría la activación de las formas independientes de este ion. En la activación de la PKC también es importante la composición del DAG; en suma, sólo los que contienen ácidos grasos insaturados en posición 2 son activadores fisiológicos de esta familia de enzimas.
Normalmente, en las células no estimuladas la PKC se asocia débilmente con la membrana; al incrementarse la concentración de sus efectores, DAG y, en algunos casos, Ca++, esta asociación se fortalece y la enzima se activa. El número de sustratos de esta familia de enzimas es enorme y participa en un amplio espectro de procesos: proliferación, diferenciación, y cambios en la estructura y movilidad celular. Es interesante indicar que una misma isoforma de PKC puede tener efectos contrapuestos en células diferentes; por ejemplo, la sobreexpresión de PKC-(3 produce un crecimiento más rápido y desordenado en los fibroblastos, mientras que en las células epiteliales lo enlentece.
Se ha determinado que la PKC es el receptor celular de los esteres de forbol, compuestos de origen vegetal que actúan como promotores tumorales. Los esteres de forbol se unen a la PKC de manera semejante al DAG y la activan de forma persistente. Estos compuestos tienen especial importancia porque constituyen el paradigma de los promotores tumorales, es decir, de aquellos compuestos que, aunque no son capaces de provocar la aparición de un tumor, favorecen su crecimiento. A diferencia de los esteres de forbol, el DAG es muy poco estable dentro de la célula y es rápidamente metabolizado por la diacilglicerolcinasa a ácido fosfatídico.
Metabolitos derivados del ácido araquidónico: prostaglandinas y leucotrienos
Los fosfolípidos de la membrana pueden ser hidroliza-dos por otras enzimas diferentes de la fosfolipasa C. Es especialmente importante la acción de la fosfolipasa A2, que libera el ácido graso que esterifica la posición 2, en una significativa proporción de casos ácido araquidónico. Después de su liberación, el ácido araquidónico se me-taboliza rápidamente a una serie de compuestos de gran interés biológico denominados leucotrienos y prostaglandinas. El paso limitante de la generación de estos compuestos es la hidrólisis del fosfolípido causada por la fosfolipasa A2.
Aunque existe también una enzima extracelular de pequeño tamaño, el metabolismo del ácido araquidónico es controlado por la actividad de una fosfolipasa A2 citosó-lica. Esta enzima depende de Ca++; cuando se producen incrementos en la concentración citosólica de este ion, la fosfolipasa A2 se activa, ya que se produce su translocación desde el citosol a la membrana, donde se localiza su sustrato. La fosfolipasa A2 también se estimula después de la activación de proteincinasas, tanto de la PKC o como de las tirosincinasas receptoras de los factores de crecimiento. El efecto de estas cinasas es indirecto y su causa es la activación de una proteincinasa denominada proteincinasa activada por mitógenos (MAPK) , que se estudiará en detalle más adelante.
Una vez liberado, el ácido araquidónico puede metabo-lizarse por dos vías principales. En la primera, después de ser el sustrato de una ciclooxigenasa, el ácido araquidóni-co se convierte en una serie de compuestos denominados prostaglandinas, de las cuales se conocen 16 diferentes. Las prostaglandinas tienen una semivida muy corta y son degradadas rápidamente, o bien secretadas. Efectos fisiológicos muy característicos de la acción de las prostaglandinas sobre sus células blanco son, por ejemplo, la contracción del músculo liso o la agregación de las plaquetas.
El ácido araquidónico puede ser metabolizado también por una 5'-lipooxigenasa, como primer paso en la síntesis de los leucotrienos. Estos compuestos, como las prostaglandinas, son inestables y después de su síntesis son degradados con rapidez. Su aparición, que muchas veces es concomitante con la de las prostaglandinas, se observa a menudo en las células que han sufrido una modificación en su ambiente. Este hecho se ha relacionado con las alteraciones de la estructura celular que ocurren en estas condiciones, puesto que alguno de estos compuestos, concretamente los leucotrienos C4 y D4, son capaces de producir modificaciones en la polimerización de la actina, uno de los principales componentes del citoesqueleto. Estas modificaciones son esenciales para muchas funciones celulares (como la movilidad y la fagocitosis) y también para procesos como la invasión bacteriana; se ha demostrado que la entrada de S. typhimurium en las células intestinales puede inhibirse si se bloquea la actividad de la lipooxigenasa.
Los inhibidores de las enzimas que participan en el metabolismo del ácido araquidónico han sido objeto de estudios farmacológicos muy intensos. Se ha comprobado que el ácido acetilsalicílico y otros compuestos antiinflamatorios (indometacina, ibuprofeno) son potentes inhibidores de la ciclooxigenasa y, por lo tanto, de la síntesis de prostaglandinas. Hasta el momento se conocen dos ciclo-oxigenasas diferentes que pueden ser inhibidas por el ácido acetilsalicílico, una constitutiva y otra inducible por estímulos inflamatorios. Se ha sugerido que la inhibición de esta última sería la causa de los efectos antiinflamatorios del ácido acetilsalicílico, mientras que la de la primera causaría los efectos colaterales perjudiciales. La búsqueda de inhibidores selectivos de la ciclooxigenasa inducible es uno de los objetivos más importantes dentro de la química farmacéutica.
Óxido nítrico
Recientemente se ha identificado un compuesto que interviene en varios procesos fisiológicos, como la actividad citotóxica de los macrófagos, la dilatación de los vasos sanguíneos o la transmisión de señal de ciertos neuro-transmisores. Este compuesto, el óxido nítrico, es un gas con estructura de radical libre, bastante estable por tratarse de uno de estos compuestos. Su síntesis se produce a partir de la arginina por medio de una enzima muy compleja denominada NO-sintetasa, que contiene sitios de unión para un elevado número de cofactores, entre ellos los grupos hem, el mononucleótido de flavina y el dinu-cleótido de flavina y adenina, y presenta bastante analogía con el citocromo P450. Además de óxido nítrico, en ausencia de arginina, la NO-sintetasa es capaz de producir un radical superóxido, otro compuesto importante por su citotoxicidad. Como podía esperarse, la actividad de la NO-sintetasa está muy regulada; de las dos formas existentes, la del cerebro y el endotelio es sintetizada constitutivamente y se activa por Ca++ y CaM, mientras que en los macrófagos la enzima es producida sólo cuando éstos se activan.
El mecanismo utilizado por el óxido nítrico para producir sus efectos está caracterizado en forma parcial. En los macrófagos y en los neutrófilos se combina con los peróxidos generados en estas células, produciéndose los radicales libres hidróxido y N02, muy activos como efectores citotó-xicos. Se ha sugerido que en las células del endotelio y también en el cerebelo los efectos del NO estarían mediados por el cGMP. El óxido nítrico se combinaría con el grupo hem de la guanilciclasa causando la activación de esta enzima y el aumento de los niveles de cGMP y, seguidamente, de la actividad de la proteincinasa dependiente de cGMP. Aunque es posible que ciertos efectos del óxido nítrico sean mediados por este mecanismo (concretamente, la relajación de los vasos sanguíneos), todavía no se conoce bien la forma en que este compuesto media los efectos de los neurotransmisores excitadores, como el glutamato, en las células cerebrales.
PROTEÍNAS EFECTORAS DEL ESTÍMULO MITOGENICO: DESDE EL RECEPTOR HASTA EL NÚCLEO
Hasta el momento se han estudiado los segundos mensajeros que se inducen en el citosol celular como respuesta a la acción hormonal y se han descrito los efectos finales que originan. Sin embargo, muchos de los efectos fisiológicos de los factores extracelulares no se deben exclusivamente a la elevación intracelular en las concentraciones de segundos mensajeros sino que existen otras vías en las cuales intervienen una serie de enzimas clave. A continuación se estudiarán varias enzimas que son activadas a menudo por los factores de crecimiento, cómo se produce su activación, qué interrelación ocurre entre ellas y qué efectos causan. Estas proteínas, presentes en todos los tipos celulares, ejercen su acción básicamente controlando el crecimiento celular. Como se verá, muchas de ellas se encuentran mutadas y activadas en diversos tumores, y la introducción de esta forma activa en ciertos sistemas celulares induce la adquisición de un fenotipo transformado. Debido a esta actividad transformante se las ha denominado protooncogenes, en sus formas normales, y oncogenes, en sus formas mutadas y activadas. Este hecho realza el papel fundamental que desempeñan en el control del crecimiento celular.
Las proteínas ras p21 son proteínas de membrana de pequeño tamaño (21 kD), producto de los genes ras. Existen tres miembros de esta familia (N, K y H ras); sus efectos sobre el control del crecimiento parecen ser bastante semejantes. En su forma activada funcionan como oncogenes, como se ha definido anteriormente.
Las proteínas ras p21 pertenecen a la gran familia de proteínas G, es decir que son capaces de unir GTP o GDP Normalmente, se encuentran unidas a GDP; su activación requiere que sean capaces de intercambiar este GDP por GTP. Este intercambio se produce de una manera bastante diferente de la activación de las proteínas G que se han mencionado antes. La ras p21 presenta una afinidad mucho mayor por GDP que por GTP; para que esta relación de afinidades se revierta es necesario que interaccione con una proteína denominada sos. La interacción de sos con ras p21 requiere la asociación de la primera con una proteína de anclaje, como GRB2, capaz de unirse a receptores de factores de crecimiento del tipo tirosincinasas, como se ha estudiado en el capítulo 1.
Además de la sos existe al menos otra proteína que modifica los niveles de GTP unidos a ras p21. Ésta, la proteína activadora de actividad GTPasa (GAP) interacciona directamente con ras p21 y estimula su capacidad de hidro-lizar GTP. Como la proteína ras p21 sólo es activa cuando se encuentra unida a GTP, se supone que GAP sería un efector negativo de ras, y así se ha comprobado en algunos sistemas; sin embargo, no puede descartarse que GAP medie alguno de los efectos de ras p21. En cualquier caso, parece claro que también GAP desempeña un papel fundamental en el control del crecimiento celular; el producto del gen que interviene en el desarrollo de la neurofibromatosis tipo I se ha caracterizado como un análogo de la proteína GAP
Existen numerosas evidencias que involucran a ras p21 en el control del crecimiento celular en numerosos tipos celulares. Experimentos en los cuales se introdujo en células ras p21 activada por una mutación puntual (permanentemente unida a GTP) o un anticuerpo bloqueante anti-ras p21 pusieron de manifiesto que esta proteína participa en la transmisión del estímulo mitogénico y determinaron que su acción se produce en un momento relativamente temprano dentro de la vía mitogénica. En la actualidad se ha caracterizado la proteína mediadora de la acción de ras; se trata de la proteincinasa producto del gen raf, raf p 72. La activación de ras p21 supone un incremento en su asociación a rafp72 y la estimulación de ésta. Hasta el momento se desconoce si la activación de rafp72 se produce exclusivamente por su asociación con ras p21 o si ésta favorece su estimulación por otro factor aún desconocido. En cambio, se sabe que su activación dispara una reacción de fosforilación en cadena de proteincinasas con múltiples efectos. Como ras, el gen raf también es un protooncogén que en su forma activada induce la adquisición de un fenotipo transformado.
Además de los tres miembros mencionados de la familia ras, existen otras proteínas de tamaño similar pero con un parecido más lejano. Éstas (entre otras, rae, rho o rap) poseen proteínas GAP específicas y se supone que deben existir también sos específicas. A diferencia de ras, su participación en el control del crecimiento celular no es clara; en cambio, parecen intervenir en la modificación de la estructura del citoesqueleto que ocurre como respuesta a los factores de crecimiento.
Proteína-serincinasas activadas por estímulos extracelulares: proteincinasa estimulada por mitógenos y sus activadores
Otra proteína clave en el control del crecimiento celular es la proteincinasa activada por mitógenos (MAPK). Esta enzima fosforila residuos de serina y treonina y se activa como respuesta a la acción de numerosos factores de crecimiento.
Su activación se produce como resultado de la cadena de fosforilación de proteincinasas disparada por raf p72.
Después de su activación, rafp72 fosforila y activa una proteincinasa denominada cinasa estimulada por MAPK (MEK), que a su vez fosforila y activa la MAPK; se trata, pues, de una cadena de reacciones semejante a la disparada por la PKA en la activación de la glucogenólisis. Esta serie de reacciones presenta algunas de las propiedades que se habían indicado para las reacciones en cadena. En primer lugar, puede ser regulada negativamente por otros efectores. En diversas líneas celulares una elevación en los niveles citosólicos de cAMP posee efecto antimitogénico; este efecto se debe a que la PKA puede fos-forilar c-raf e inhibir su actividad proteincinasa sobre la MEK. La vía es también un punto de convergencia de otros estímulos mitogénicos: además de raf p72 se han caracterizado otras proteínas con actividad cinasa sobre la MEK y capaces de activarla, entre ellas, algunas formas de la PKC.
La MAPK es una proteincinasa que actúa sobre un número bastante elevado de sustratos, muchos de ellos con actividades absolutamente diferentes. La única relación que muestran todos ellos es que contienen una secuencia de aminoácidos Pro-X-Ser(Thr)-Pro, en la que la serina o la treonina es la que se fosforila; por eso la MAPK da nombre a un grupo de proteincinasas denominadas dependientes de prolina. En apartados anteriores ya se ha mencionado un sustrato de esta enzima, la fosfolipasa A2, participante en la liberación de ácido araquidónico y que resulta activada después de su fosforilación. Pero existen otros, presentes tanto en el citosol como en el núcleo, ya que después de ser activada la MAPK se transloca a este compartimiento.
La MAPK es el paradigma de una familia de enzimas de características moleculares semejantes y reguladas de una manera similar. Además de la MAPK, recientemente se ha descrito otra enzima, la proteincinasa activada por estrés (SAPK), que fosforila la proteína nuclear c-jun, incrementando su actividad como factor estimulador de la transcripción de numerosos genes.
La cadena de reacciones raf p72 > MEK > MAPK constituye un buen ejemplo de lo que se ha denominado módulo o cásete de reacciones en las vías de transmisión de señales. Con este nombre se conoce a una serie de proteincinasas ligadas entre sí que se encuentran involucradas en efectos celulares diferentes. Estas proteincinasas estarían reguladas de una manera semejante a la cadena de cinasas raf p72 > MEK > MAPK y sus miembros presentan grandes analogías con los situados en sus lugares correspondientes. Esta cásete de reacciones se ha encontrado en organismos tan dispares como las levaduras o las células epiteliales de los mamíferos; esto indujo a pensar que se habría heredado tempranamente durante el transcurso de la evolución, sufriendo ciertas variaciones que le habrían permitido ser utilizada por la célula en diferentes vías. Así, una cadena de reacciones que implica a análogos de raf p72, MEK y MAPK parece estar involucrada en el control de la forma celular por agentes externos. El cásete de reacciones sería un elemento funcional de control utilizado con ligeras variantes en muchos procesos diferentes.
La compleja cascada de reacciones que se resumen en las figuras 1-3 y 2-4 permite comprender cómo la activación de un receptor de membrana de un factor de crecimiento extracelular es capaz de activar la transcripción de un gen. El conocimiento actual de esta serie de reacciones sólo explica algunos de los efectos mitogénicos de estos factores, pero es ya un gran avance en relación con la gran caja negra que constituían los procesos de transmisión de la señal hormonal hace unos años. El desafío actual consiste en comprender cómo alguno de los eslabones de esta cadena se encuentra ligado con las enzimas que controlan directamente la duración del ciclo celular: los complejos factor promotor de la entrada en fase M (MPF) y factor promotor de entrada en fase S (SPF).
Proteincinasas participantes en el control del ciclo celular: complejos factor promotor de la entrada en fase M y factor promotor de la entrada en fase F
Durante su ciclo de crecimiento y división, una célula pasa por diversas fases, que en orden correlativo se denominan Gv S (cuando ocurre la síntesis del DNA), G2 y M (mitosis). Las transiciones GrS y G2-M son los puntos principales de control del ciclo, cuando se determina si la célula entrará en división o no. Los mitógenos ejercen su acción controlando la duración de la fase G1( es decir, la entrada de la célula en la fase S. Estos mecanismos de control, y los genes implicados en ellos, están muy conservados en todas las células eucariotas; son prácticamente idénticos en las levaduras y en las células humanas.
Recientemente se han identificado los genes que controlan en forma directa la entrada de la célula en las fases S y M. Al principio se caracterizó el factor que regulaba la transición G2-M, al que se denominó factor promotor de la entrada en mitosis (MPF). Este factor presenta actividad proteincinasa y está compuesto por dos subunidades. La primera, denominada p34 o cdc2 por su analogía con un gen de levadura, es la responsable de la actividad catalítica. La subunidad reguladora se ha denominado ciclina porque sus niveles oscilan durante el ciclo celular; es sintetizada antes de la entrada en la fase M y degradada inmediatamente después. Por analogía con el MPF, se ha pensado en la existencia de un complejo factor promotor de la entrada en la fase S (SPF); diversos hallazgos sugieren que este complejo debe estar formado por una subunidad idéntica o muy parecida a la p34 y una ciclina diferente de la que forma parte del MPF. La activación del MPF es un proceso complejo que requiere la síntesis de la ciclina y la modificación de varios residuos de la p34.
Como la MAPK, el MPF es una cinasa de acción pleio-trópica. De sus sustratos, el mejor caracterizado es la proteína lamina, que constituye la cubierta nuclear. Su fosforilación causa el desacoplamiento de esta estructura, un proceso que conduce a la disolución del núcleo, que es el primer paso de la mitosis. Además de la lamina, el MPF tiene múltiples sustratos puesto que este factor por sí solo es capaz de provocar la entrada en mitosis de células que se encuentran detenidas en la transición G2-M. Sin embargo, aunque se conocen algunos activadores del MPF, todavía no ha sido posible reconstruir una vía que lo una con alguna de las enzimas estimuladas por mitógenos que se han estudiado anteriormente, como MAPK, raf p 72 o ras p21.
