El desarrollo de un individuo a partir de un huevo fecundado constituye, sin duda, uno de los problemas biológicos más atrayentes. Es indudable también que el progreso alcanzado por las técnicas de recombinación del DNA ha permitido abordar problemas pendientes en la embriología durante años y que ahora se empiezan a entender en un nivel de explicación más profundo. El punto de partida de la biología actual fue la dilucidación de la estructura del DNA y el código genético, pero las técnicas de recombinación del DNA aplicadas a los problemas del desarrollo embrionario de los vertebrados comenzaron a despegar, a dar frutos y a esbozar su futura evolución en la década de los años ochenta. La capacidad de resolver en el nivel molecular significa un avance enorme para la embriología porque los genes y las moléculas constituyen el lenguaje de las células. En la regulación de la expresión de los genes y en las interacciones entre las células se intenta localizar las claves y dilucidar los principios que gobiernan el desarrollo.
La embriogénesis es un crecimiento proliferativo muy organizado en las tres dimensiones del espacio. De ello resulta un organismo en el cual los diferentes órganos y sistemas están constituidos por células características que guardan entre sí relaciones también características. ¿Cómo se marcan el tiempo y el espacio en el embrión? ¿Cómo se organizan las células en estructuras tridimensionales? ¿Cómo se especifican el lugar que ocupa cada parte del organismo, sus posiciones relativas, sus tamaños?
En este entramado de procesos biológicos se distinguen clásicamente cuatro: proliferación celular, diferenciación celular, morfogénesis y especificación regional. El crecimiento es el fenómeno más obvio del desarrollo y el que puede identificarse con mayor facilidad. Es consecuencia, en gran medida, de la multiplicación celular, y de este modo una célula única da origen a todas las células del organismo recién nacido. Cada una de ellas posee rasgos típicos, determinados por el mosaico de genes y proteínas que expresa. Esto se denomina diferenciación celular; el estado de diferenciación depende en cada célula de su historia y de la de sus ancestros. Por especificación regional se entiende la adscripción de territorios dentro del embrión, la organización topológica, el lugar donde debe estar cada cosa, cada parte. Nuestras manos y nuestros pies no son muy distintos en cuanto a su composición celular; contienen tipos celulares similares (músculo, cartílago, huesos, tendones). Lo importante en cada caso no es su naturaleza diferente sino suposición obligada. ¿Qué principios sigue el embrión para adscribir a cada parte un lugar único y típico? ¿Cómo se determina lo que es anterior y lo que es posterior? ¿Cómo se definen los ejes de simetría? Éstas son las cuestiones típicas de la especificación regional. Otro problema diferente es el de la morfogénesis. Siguiendo con el ejemplo de la mano y el pie, cabría preguntarse: una vez colocado cada uno en su lugar, ¿cómo organizar los mismos tejidos (los mismos tipos de células) en forma de pie o en forma de mano? Es importante distinguir bien entre morfogénesis, como generación de una estructura tridimensional a partir de un grupo de células, y diferenciación, término que se refiere al carácter de cada célula.
El control de la proliferación y la diferenciación celulares durante el desarrollo contiene elementos que se manifiestan también de manera normal o anormal en la fisiología del adulto, y un buen ejemplo de ello lo constituyen las alteraciones celulares que se producen durante la transformación tumoral. La especificación regional y la morfogénesis no tienen equivalencia en el adulto, son característicos del desarrollo embrionario; sin embargo, y en forma sorprendente, como se verá más adelante, pueden compartir piezas de sus mecanismos moleculares.
MOLÉCULAS DE LA INDUCCIÓN EMBRIONARIA
El desarrollo embrionario humano dura 9 meses, pero el plan básico de organización del organismo se determina en las primeras semanas de vida, en las primeras horas en algunos otros vertebrados. Es aquí cuando, a partir de un grupo de células aparentemente homogéneas, se establecen los primeros ejes de simetría, las tres capas embrionarias primarias y un organismo en miniatura. El proceso tiene características propias en los diferentes vertebrados pero comparte un plan básico común.
Como consecuencia de las primeras divisiones celulares, el blastocisto que se implanta en la mucosa uterina contiene ya un botón embrionario constituido por dos capas celulares con destinos diferentes: el epiblasto, que va a formar el embrión, y el hipoblasto. En el embrión humano la línea primitiva surge aproximadamente a las 2 semanas de desarrollo y un poco más tarde el nodo de Hensen, con lo cual se inicia \a gastrulación, probablemente como consecuencia de una primera interacción entre el hipoblasto y el epiblasto, que dispara en éste la inducción de una zona organizadora y la formación de las tres capas celulares definitivas del embrión: el ectodermo, el endodermo y el mesodermo. Los experimentos clásicos de Waddington demostraron que el nodo de Hensen es equivalente al labio dorsal del blastoporo de los anfibios, estructura que tiene la característica de ser el organizador. Su experimento fue sin duda el más clásico de la embriología y consistió en injertar el labio dorsal del blastoporo de una blástula en otra, lo cual generó un punto de inicio de la gastrulación ectópico y, como consecuencia, una duplicación del eje dorsal de un animal. A partir de entonces la embriología ha tratado de entender la naturaleza de este proceso. El destino de las células del organizador es producir la notocorda, el mesodermo cefálico, los somites y el endodermo, y además inducir la formación del tubo nervioso. Esta región tiene, a su vez, la propiedad de inducir actividad organizadora, sintetiza ácido retinoico, que a su vez inhibe algunas de sus funciones y, como se verá más adelante, expresa genes característicos.
El estudio de la gastrulación en los anfibios ha orientado sobre la posible naturaleza de esta interacción. La activina es una molécula de la familia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-(3) que muestra la capacidad de inducir experimentalmente tejido mesodérmico a partir del ectodermo primitivo (el epiblasto). El tipo de mesodermo inducido por la activina depende de la concentración, de modo que las concentraciones altas de activina inducen el mesodermo dorsal (notocorda, músculo), mientras que las más bajas inducen mesodermo con características laterales (mesénquima, sangre). Más interesante aun es el hecho de que la activina es capaz de inducir actividad organizadora, de modo que el trasplante de células ectodérmicas tratadas con activina produce una duplicación axial. El factor de crecimiento fibroblástico básico (FGFb) constituye también un factor de inducción mesodérmica, pero es incapaz de inducir actividad organizadora o mesodermo axial. Ambos factores se pueden detectar en el blastocisto y la manipulación genética de sus receptores genera defectos embrionarios muy tempranos. Así, los ratones transgénicos que sobreexpresan receptores truncados de activina carecen de mesodermo y los de FGFb no tienen estructuras posteriores. Se desconoce si éstos son los únicos factores de inducción mesodérmica o si, de hecho, son los responsables in vivo de la inducción. Otros genes, la familia wnt y los genes noggin (ng) o sonic hedgehog (shh) codifican proteínas segregadas al medio extracelular y son candidatos a formar parte de los sistemas de señalización. Muy probablemente se requieren combinaciones de señales para generar un proceso final, como lo sugeriría la demostración de que la activina muestra ventanas para inducir la expresión de genes mesodérmicos, es decir que los genes inducidos por activina lo hacen sólo en un espectro de concentraciones de activina. Pues bien, la presencia de FGFb mueve los espectros de concentración en los cuales la activina produce su efecto. En consecuencia, la acción de factores de crecimiento liberados por la capa profunda del embrión bilaminar (el hipoblasto) podría inducir la actividad organizadora y la generación de las tres capas en el epiblasto. La regionalización de la expresión de la activina, los FGF y sus diferentes receptores, permitiría generar localmente combinaciones únicas y especificar la región organizadora, que a su vez tendría actividad inductora mediante la liberación de nuevas señales.
Determinar que una región definida por su actividad o su destino en el desarrollo se halla bajo el dominio de expresión de un gen o grupo de genes y relacionarlos en un esquema de operación es quizás una de las aspiraciones de la moderna biología del desarrollo. De Robertis y su grupo se preguntaron qué caracteriza al organizador desde un punto de vista molecular, y llevaron a cabo una búsqueda de genes con homeodominio, en una genoteca de cDNA obtenida por microdisección de los labios dorsales del blastoporo del Xenopus. Este trabajo permitió identificar un nuevo gen denominado goosecoid (gsc), que codifica un factor de transcripción y cuyo patrón de expresión temprano se superpone con el organizador de Spemann. Además, gsc se expresa en las aves y los mamíferos en el nodo de Hensen, tal y como cabría esperar de un gen característico del organizador. El gen gsc se regula como la actividad organizadora, de modo que es inducido por la activina y por wnt pero no por FGFb, y es inhibido por la radiación ultravioleta y por el ácido retinoico. La inyección de mRNA de gsc en células del blastocisto induce un centro de organización ectópico y un eje secundario. Mediante los marcadores moleculares y el examen estructural se puede mostrar, además, que la dosis de inyección de mRNA de gsc determina el tipo de mesodermo inducido. La expresión de gsc muestra al menos tres umbrales diferentes para especificar cuatro tipos distintos de mesodermo (notocorda, músculo, pronefros y sangre) y esto coincide con la distribución gradual de dorsal a ventral que la expresión de gsc muestra en el blastocisto. Un modelo de cómo podría organizarse la inducción mesodérmica sobre la base de un gradiente de expresión de gsc inducido a su vez por la interacción del polo vegetal con el polo animal se muestra en la figura. El gen noggin se coexpresa con gsc y es un factor soluble con actividad de inducción mesodérmica dorsal. Sería, pues, un excelente candidato para ser la señal posicional enviada como consecuencia de la especificación por gsc.
ORGANIZACIÓN REGIONAL DEL SISTEMA NERVIOSO
Al mismo tiempo que se produce la gastrulación y se generan las tres capas embrionarias, comienza la especificación del ectodermo que da origen al neuroepitelio, futuro sistema nervioso, y al ectodermo, la futura piel del embrión. Este proceso se origina el día 19 en el embrión humano, con la formación de la placa neural que dará origen al cerebro y la médula espinal, y finaliza hacia la cuarta semana con la fusión de los pliegues neurales. Desde muy temprano existe una especificación regional y se determinan dos ejes de simetría del tubo nervioso: uno dorsoventral y otro anteroposterior. Este último es fácilmente visible por la organización morfológica que permite diferenciar los primordios del futuro cerebro, el prosencéfalo, el mesencéfalo y el rombencéfalo, y en posición más caudal, el tubo nervioso que dará origen a la médula espinal.
En el origen de la formación del tubo nervioso se han colocado tradicionalmente señales de origen mesodérmico, en gran medida a partir de los experimentos de Spemann y Mangold. En ellos se mostraba que el origen de las células del tubo nervioso, inducido ectópicamente por el organizador, era el receptor, y el tejido organizador donante contribuía sólo a la notocorda y parte del mesodermo, el paraaxial. Aquí se fraguó el concepto de inducción como interacción instructiva entre dos tejidos. Se trata, pues, de un tejido que envía señales a otro de modo que éste modifica su estado o destino embrionario de acuerdo con la señal recibida.
Se han descrito por lo menos dos moléculas con propiedades de inducción neural. Una es follistatin (fol), que muestra una actividad inductora neural per se, sin la inducción paralela de los marcadores mesodérmicos y con un dominio de expresión localizado en el organizador, el mesodermo precordal y la notocorda. Follistatin es inducida por la activina pero no por noggin y, a su vez, se liga a la activina inhibiendo sus efectos. El otro gen con actividad de inducción neural es noggin (ng), aislado de clones con capacidad de rescatar la inducción neural después del tratamiento con radiación ultravioleta. Noggin codifica una proteína segregada que se expresa en el organizador y el mesodermo axial. También es inducido por la activina pero no por follistatin, y viceversa. Las actividades inductoras de ngyfol no son idénticas en cuanto a los marcadores neurales inducidos, de modo que su combinación podría inducir diferentes subtipos de neuroepitelio y por lo tanto codificar diferencias regionales.
El tráfico de señales no necesariamente cursa de forma exclusiva del mesodermo al ectodermo, y es posible que las señales de inducción y especificación territorial se den también en el plano del epiplasto. Esta idea proviene de un nuevo análisis de los experimentos clásicos de Holftreter en los cuales se induce una exogastrulación al exponer la blástula a un medio hipotónico, evitando así la interacción entre el mesodermo y el ectodermo. En estos casos se puede demostrar que existe diferenciación neural, a juzgar por la expresión de ciertos marcadores como N-CAM, b-TUB, NF-3, En y otros. Esto ha llevado a postular señales planares que operarían en espectros cortos, en el dominio bidimensional del epiblasto. El gen sonic hedgehog (shh), se ha postulado como un posible candidato para este papel.
Como se mencionó antes, las diferencias regionales en el tubo nervioso a lo largo del eje anteroposterior pueden detectarse fácilmente. En un principio se mostró, también en forma experimental, que las propiedades inductoras del mesodermo anterior y posterior también son diferentes. Las bases moleculares del origen de esta regionalización son aún desconocidas y es posible que en él estén las combinaciones de señales inductoras verticales (de origen mesodérmico) y planares. Sea como fuere, se genera la especificación anteroposterior y la cuestión siguiente es: ¿qué hace a unas regiones diferentes de las otras, cómo se codifican esas diferencias, cuál es el lenguaje que utiliza el embrión para conferir a cada parte del tubo nervioso su identidad? El estudio de los genes homeoticos de Drosophila ha proporcionado algunas claves posibles al respecto. El término se refiere estrictamente a aquellos genes cuya mutación nula transforma una región de la mosca en otra, por lo que se cree que normalmente especifica la identidad de los segmentos de la mosca. Se trata de ocho genes agrupados en dos complejos génicos: antennapedia (ANT) y bithorax (BX), denominados colectivamente HOM-C. Su defecto produce los espectaculares ejemplos de la transformación de una antena de la cabeza en una pata o la generación de moscas con cuatro alas. Estos genes se caracterizan por poseer un dominio de unión al DNA común, denominado homeobox. Comparten este homeodominio con otros genes reguladores cuya mutación no produce necesariamente cambios homeoticos, de modo que los términos homeobox gene y homeotic gene no son intercambiables.
La búsqueda de los homólogos de los genes homeoticos de la Drosophila en los vertebrados estuvo determinada por la posibilidad de aplicar los principios de organización metamérica descubiertos en la mosca. La confirmación de que la regionalización del sistema nervioso implica una organización segmentaria, y de que ésta se extiende anteriormente en el sistema nervioso es relativamente reciente, aunque esta idea ha sido postulada hace mucho tiempo. Los genes hox constituyen los homólogos de los complejos homeoticos de los vertebrados. Los genes hox del ratón y del hombre están organizados en cuatro complejos (hox A, hox B, hox C y hox D), generados posiblemente por duplicación y divergencia de un ancestro común. Dentro de cada complejo los genes están ordenados de modo que los genes homólogos ocupan las mismas posiciones dentro del complejo y se denominan paralogos. De manera similar a lo que ocurre en la mosca, la expresión de los genes hox se caracteriza por seguir un patrón caudocraneal y por mostrar límites segmentarios, de modo que, arrancando en el extremo caudal, cada gen muestra un límite anterior característico y que coincide con una frontera metamérica. Por alguna razón aún desconocida, la expresión de los genes dentro de cada complejo sigue un orden fijo, de modo que los genes colocados en la región más 3' son los que muestran un límite más anterior y los 5, más posterior (expresión colineal). La consecuencia de ello es que cada segmento contiene una combinación característica de genes hox que lo diferencia de los segmentos anterior y posterior. El ejemplo más claro surge de los estudios de expresión de los hox en el rombencéfalo y su coincidencia con los límites anatómicos de los rombómeros, estructuras de apariencia segmentaria que aparecen en forma transitoria en el desarrollo temprano del rombencéfalo. De hecho, se puede demostrar que la expresión de los genes hox y de otros genes segmentarios es previa a la formación de los rombómeros.
La expresión metamérica de los genes hox se extiende a la cresta neural y sus derivados. La cresta neural constituye una subpoblación celular de origen ectodérmico que se especifica muy temprano en los pliegues neurales a lo largo de todo el tubo nervioso y que muestra una enorme potencialidad en cuanto a su capacidad de migración y generación de diversos tipos celulares que van desde las neuronas vegetativas y sensoriales del tronco y algunos ganglios craneales a la glía, el cartílago y el hueso del macizo craneofacial y los melanocitos de la piel. La cresta neural participa, pues, del mismo código de expresión de genes hox, de modo que los arcos branquiales muestran límites precisos para la expresión de los diferentes genes hox, siguiendo el mismo patrón colineal del rombencéfalo.
Mediante el uso de técnicas de ingeniería genética se han llevado a cabo experimentos por los cuales se trataba de inducir mutaciones en los genes hox, con el propósito de indagar su posible función homeótica. Al parecer, las mutaciones nulas de algunos genes hox sugieren que esto es lo que ocurre cuando se pierde la especificación de los rombómeros afectados. El ácido retinoico es capaz de mimetizar algunos de estos cambios homeoticos y su efecto es paralelo a la alteración de los límites de expresión de los genes hox, que en forma característica se hacen más anteriores. Dado que los genes hox contienen elementos de respuesta al ácido retinoico y que éste es capaz de inducir su expresión siguiendo un patrón colineal, se sospecha que el ácido retinoico, al que desde hace mucho se lo conoce como una molécula con profundos efectos sobre el desarrollo y la teratogénesis, podría desempeñar un papel en la secuencia normal de activación de los genes hox.
Merece la pena mencionar aquí, aunque sea brevemente, que el principio de organización metamérica parece extenderse a lo largo de todo el cerebro, incluyendo las regiones más anteriores. Esta idea ha sido muy discutida hasta hace muy poco tiempo, debido en parte al desconocimiento de genes con dominios de expresión anterior y a la complejidad anatómica del cerebro. La elaboración de modelos morfológicos adecuados y la exploración de los dominios temporales y espaciales de expresión de una variedad de genes, entre ellos, genes de la familia wnt, pax y otros con dominios homeoticos (dlx y otx), ha permitido elaborar modelos en los cuales se puede identificar un principio de organización neuromérica extendida hasta el telencéfalo y en la que se han propuesto unidades metaméricas denominadas prosómeros.
ONCOGENES Y DESARROLLO EMBRIONARIO
El descubrimiento de que el genoma humano contiene secuencias homologas a las de los retrovirus transformantes fue muy importante para la elaboración de teorías sobre el cáncer, pero a la vez abrió una perspectiva nueva en la identificación de genes críticos para el control de la proliferación y la diferenciación celulares. El nexo se hizo más firme al descubrirse que muchos de los productos codificados por los protooncogenes son factores de crecimiento y moléculas involucradas en sus vías de señalización celular. Los factores de crecimiento tienen efectos pleiotrópicos, controlan la proliferación y la diferenciación celulares y constituyen potencialmente moléculas de comunicación entre las células. Por lo tanto, los oncogenes han proporcionado una base para la comprensión de la relación no muy clara entre la embriogénesis y la transformación tumoral. Los estudios de expresión in situ de varios protooncogenes durante el desarrollo embrionario han revelado patrones de expresión restringidos espacial y temporalmente, lo que ha permitido asociar genes concretos con pasos definidos en la secuencia de instrucciones que se suceden durante la embriogénesis. Se analizarán aquí dos casos ilustrativos, los de los protooncogenes wnt y trk.
La familia de genes writ codifica unas proteínas de aproximadamente 190 kD, muy conservadas a lo largo de la escala filogenética. Su nombre deriva del reconocimiento de que el int-1, identificado como un protooncogén activado por integración vírica, presentaba una homología estructural con un gen conocido en la Drosophila como el gen wingless, clave en la metamerización y la generación de la organización segmentaria de la mosca.
El patrón de expresión de wnt-1 en el ratón sugiere un papel multifuncional en el desarrollo de los mamíferos. Los transcritos de wnt-1 pueden detectarse en una etapa temprana de la gastrulación, en la placa neural temprana, el rombencefalo y el mesencéfalo durante la neurulación y, más tardíamente, en otras áreas del sistema nervioso. Al igual que en la mosca, wingless mantiene en el tubo nervioso de los vertebrados la expresión del gen engrailed (En), un factor de transcripción cuya expresión puede detectarse restringida a áreas muy discretas del mesencéfalo y del rombencefalo. El examen de un ratón transgénico, nulo para wnt-1, en el que se observó un hallazgo notable, la ausencia completa del mesencéfalo, proporciona una sugerencia sobre el significado de esta expresión de wnt-1.
La expresión temprana de wnt-1 durante la formación de la línea primitiva indica también su posible participación durante la gastrulación y la especificación axial temprana (v. antes). De acuerdo con esta idea, la microinyección de mRNA de wnt-1 en las células vegetales de la blástula de Xenopus origina la duplicación de los centros de organización y del eje dorsal.
El caso de los protooncogenes de la familia trk es también muy interesante porque ha permitido identificar en forma inesperada unos receptores que los investigadores interesados en el desarrollo del sistema nervioso buscaban hacía mucho tiempo. A partir de los clásicos experimentos de Rita Levi-Montalccini y Victor Hamburger, se identificó una serie de moléculas con propiedades tróficas sobre poblaciones neuronales. La idea inicial fue que estos factores tróficos, cuyo prototipo es el factor de crecimiento neural (NGF), permiten la supervivencia de ciertas poblaciones neuronales en el individuo adulto. Se los concibió como factores sintetizados por las dianas neuronales y se postuló que, durante el desarrollo, contribuyen a ajustar los conjuntos de neuronas a los territorios inervados, seleccionando sólo aquellas que deben sobrevivir a partir de un conjunto más amplio. Por técnicas de purificación química y de recombinación se han identificado otros factores relacionados estructuralmente con el NGF, de modo que en la actualidad se habla de la familia de las neurotrofinas, que comprende el NGF, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina 3 (NT-3) y la neurotrofina 4/5 (NT-4/5). Ahora también resulta claro que además del mencionado papel trófico, de mantenimiento de la supervivencia neuronal, estos factores tienen efectos biológicos más variados según el tipo de neurona, que incluyen, por ejemplo, la proliferación y la diferenciación neuronales. Una clave para interpretar esta diversidad de funciones y elaborar un modelo general para la biología de las neurotrofinas fue proporcionada por la clonación y la secuenciación de una familia de receptores de alta afinidad para estas moléculas, los receptores trk. El gen trk fue aislado como un oncogén con actividad proteincinasa, a partir de tumores humanos. El estudio del patrón de expresión del protooncogén trk durante el desarrollo embrionario mostró en forma inesperada su superposición con los territorios que clásicamente se conocen como dependientes del NGF. Por otra parte, el análisis de clones similares al gen trk permitió identificar una familia de genes, trk A, trk B, trk C, que codifican receptores de membrana con un dominio intracelular catalítico, tirosincinasa, y que ligan de manera preferente alguna de las neurotrofinas. Los experimentos recientes de ratones mutantes nulos para diferentes neurotrofinas o trk han permitido comprobar que estas moléculas desempeñan un papel determinante en el desarrollo del sistema nervioso. El principio general es que la expresión, restringida en el tiempo y en el espacio, de los factores y sus receptores permite especificar poblaciones de neuronas cuyo desarrollo y supervivencia dependen así de sus interacciones con los territorios con los cuales estas neuronas establecen contactos sinápticos. Se trata, pues, de un posible principio utilizado en el etiquetado correcto de las neuronas en el sistema nervioso.
